矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠免疫細胞因子TNF-α、IL-1β水平的影響*

曹慶生，李志超，韓立旺，張永華，張艷莉，胡穎杰，李紅莉，張文亞

1.河北省唐山市玉田縣醫院病理科，河北唐山 064100，2.河北省唐山市玉田縣中醫醫院疼痛科，河北唐山 064100

肝臟受到各種慢性損傷時，可刺激免疫調控細胞分泌大量免疫調控因子，使肝星狀細胞活化、增殖，合成大量膠原，導致細胞外基質肝內大量沉積，纖維化形成。同時，活化的肝星狀細胞也可通過自分泌和旁分泌作用于免疫調控細胞，維持自身活化并激活臨近肝星狀細胞。因此，免疫調控在肝纖維化的發生、發展中發揮著重要作用[1-2]。由于肝纖維化機制復雜，西醫治療肝纖維化缺乏顯著效果的藥物。我國是傳統中藥大國，利用中藥治療肝病歷史悠久，且中草藥來源廣泛、種類繁多。中藥黃酮類有抗炎、抗氧化、調節炎癥因子、保肝的作用，在肝纖維化預防和治療方面具有多靶點、費用低、不良反應小等優勢，已成為目前新藥研究的熱點[3-4]。矮地茶為紫金牛科植物紫金牛Ardisiajaponica(Hornst.)BL.的干燥全草，我國南方各省均有分布，《本草綱目》中記載有“解毒破血”的功效，臨床治療咳嗽、咳痰、慢性支氣管炎、利尿祛濕、濕熱黃疸等?，F代研究表明，矮地茶具有黃酮類(槲皮素)、香豆素(巖白菜素和異巖白菜素)、揮發油等化合物，具有祛痰止咳、免疫調節、抗炎、抗病毒、降血糖等功效[5]。前期研究已證實，矮地茶黃酮對四氯化碳所致急性肝損傷有保護作用，對二甲基亞硝胺誘導的大鼠肝纖維化具有降酶、保肝、抗氧化等功效[6]。因此，本文通過觀察矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)水平的影響，同時觀察肝纖維化其他指標，如血清透明質酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)水平，肝臟纖維化分級以及肝臟波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達情況，并進行對比及相關性分析，探討矮地茶黃酮能否通過影響機體免疫功能達到防治肝纖維化的效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只SPF級斯潑累格·多雷(SD)大鼠由桂林醫學院動物實驗中心提供，并在動物實驗中心完成肝纖維化模型制備及藥物干預，許可證號：SCXK2013-0001。

1.2藥物與試劑 矮地茶購自桂林六合路藥材市場并由張可鋒教授鑒定，制備成矮地茶黃酮。矮地茶黃酮制備方法：取矮地茶全草1 kg，粉碎后加入60%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，提取液過濾后，減壓回收乙醇，濃縮成矮地茶黃酮浸膏。浸膏加蒸餾水充分混勻，鹽酸調節pH值為5，D102型大孔吸附樹脂純化，流速3 mL/min，靜置12 h后，分別用35%乙醇(2倍樹脂體積)、70%乙醇(4倍樹脂體積)洗脫，流速2.5 mL/min，收集70%乙醇洗脫液，測定其總黃酮濃度為71.2%(硝酸鋁絡合分光度法)。TNF-α、IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司；Vimentin、α-SMA一抗購自深達生物技術有限公司。

1.3模型制備及藥物干預 將SD大鼠按隨機原則分為5組(正常組，模型組，矮地茶黃酮高、中、低劑量組)，每組12只。參考高雅等[7]方法構建肝纖維化模型：用蒸餾水將二甲基亞硝胺稀釋為0.5%，按2 mL/kg的劑量腹腔注射，隔天1次，共8周。同時，矮地茶黃酮組按600、400、200 mg/kg灌胃給藥，正常組、模型組灌服等量蒸餾水，均每天1次。

1.4觀察指標 禁食、禁飲后，于大鼠眼球取血，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平。剖開腹腔取肝左葉標本，常規取材脫水制片，顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟纖維化程度，診斷標準參考《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[8]，免疫組織化學方法檢測各組大鼠肝臟Vimentin、α-SMA表達情況。免疫組織化學結果判定標準：Vimentin、α-SMA以細胞質呈棕黃色為陽性細胞。按染色強度打分：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細胞比例打分：陰性0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分，二者相加，給出得分。

2 結 果

2.1矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響 實驗結束時，正常組無死亡，模型組死亡3只，矮地茶黃酮高、中、低劑量組分別死亡2、2、1只。模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)；矮地茶黃酮高、中劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；矮地茶黃酮低劑量組大鼠血清中血清中TNF-α、IL-1β水平與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平的影響 模型組大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平明顯高于正常組，矮地茶黃酮高、中劑量組大鼠血清中血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平明顯低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；矮地茶黃酮低劑量組大鼠血清HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平與模型組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，矮地茶黃酮低劑量組大鼠血清LN水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清TNF-α、IL-1β 的影響

表2 矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平的影響

2.3各組大鼠肝臟病理形態學比較 正常組大鼠肝臟顏色紅潤，光滑，柔軟，有光澤；模型組大鼠肝臟顏色灰黃，光滑度下降，表面結節狀，邊緣不規則，質地硬，缺少光澤；各用藥組大鼠肝臟顏色、質地、光滑度優于模型組。顯微鏡觀察觀察病理切片，正常大鼠肝細胞結構完整，無變性壞死，肝竇有出血，匯管區無炎細胞浸潤及纖維組織增生；模型組大鼠肝細胞排列紊亂，結構不完整，肝細胞變性壞死，匯管區內毛細血管數量明顯增多，大量炎癥細胞浸潤，纖維增生明顯，部分有假小葉形成。矮地茶黃酮高劑量組、矮地茶黃酮中劑量組大鼠肝組織結構較完整，肝細胞變性壞死輕、匯管區毛細血管增生不明顯，纖維化程度輕，小葉結構較完整，纖維化程度與模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。矮地茶黃酮低劑量組部分大鼠肝組織結構紊亂，變性壞死不明顯，匯管區毛細血管數量增多，炎細胞浸潤和纖維化程度改善不明顯，有假小葉形成，纖維化程度與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3及圖1。

表3 矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠肝臟纖維化程度的影響(n)

注:A為正常組；B為模型組；C為矮地茶黃酮高劑量組；D為矮地茶黃酮中劑量組；E為矮地茶黃酮低劑量組。

2.4各組大鼠肝臟中Vimentin、α-SMA表達情況 利用Vimentin染色觀察各組大鼠肝臟細胞外基質增生情況，模型組大鼠肝臟匯管區Vimentin彌漫陽性，染色范圍及強度均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，矮地茶黃酮高劑量組、矮地茶黃酮中劑量組大鼠肝臟細胞外基質明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，矮地茶黃酮低劑量組大鼠肝臟細胞外基質降低不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4及圖2。利用α-SMA染色標記活化的肝星狀細胞，觀察各組大鼠肝臟活化的肝星狀細胞增生情況，模型組大鼠肝臟染色范圍及強度明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，矮地茶黃酮高劑量組、矮地茶黃酮中劑量組大鼠肝臟活化的肝星狀細胞明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，矮地茶黃酮低劑量組大鼠肝臟活化的肝星狀細胞降低不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4及圖3。

表4 矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠肝臟中Vimentin、α-SMA表達的影響

注：A為正常組；B為模型組；C為矮地茶黃酮高劑量組；D為矮地茶黃酮中劑量組；E為矮地茶黃酮低劑量組。

注：A為正常組；B為模型組；C為矮地茶黃酮高劑量組；D為矮地茶黃酮中劑量組；E為矮地茶黃酮低劑量組。

2.5TNF-α、IL-1β與肝纖維化各指標的相關性分析 模型組中，血清TNF-α、IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，肝α-SMA、Vimentin的表達水平與肝纖維化分級均呈正相關(r=0.906、0.814、0.811、0.748、0.811、0935、0.748、0.686，均P<0.05)；血清TNF-α 水平與IL-1β、HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平呈正相關(r=0.740、0.797、0.746、0.898，均P<0.05)，與肝α-SMA、Vimentin的表達水平呈正相關(r=0.898、0.704，均P<0.05)，血清TNF-α水平與LN水平無相關性(r=0.545，P>0.05)；血清IL-1β水平與HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平呈正相關(r=0.854、0.887、0.996、0.904，均P<0.05)，與肝α-SMA、Vimentin的表達水平呈正相關(r=0.799、0.781,均P<0.05)。

矮地茶黃酮組中，血清TNF-α、IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，肝α-SMA、Vimentin的表達水平與肝纖維化分級均呈正相關(r=0.934、0.922、0.627、0.500、0.917、0.870、0.799、0.729，均P<0.05)；血清TNF-α水平與IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平呈正相關(r=0.922、0.645、0.515、0.957、0.941，均P<0.05)，與肝α-SMA、Vimentin的表達呈正相關(r=0.804、0.712,均P<0.05)；血清IL-1β水平與HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平呈正相關(r=0.665、0.548、0.927、0.862，均P<0.05)，與肝α-SMA、Vimentin的表達呈正相關(r=0.851、0.733,均P<0.05)。

3 討 論

肝纖維化的發病機制復雜。有研究表明，肝纖維化的發生、發展與人體免疫系統功能紊亂密切相關，如作為機體重要的固有免疫細胞-巨噬細胞，在肝星狀細胞的增殖、活化中發揮著重要作用，而肝星狀細胞的增殖、活化在肝纖維化發生、發展中發揮核心作用；巨噬細胞受到外界有害因素刺激時，其受體能將其識別并產生應答，分泌大量轉化誘導因子β1、TNF-α、IL-1β等炎癥因子，進一步活化肝星狀細胞為成纖維細胞，產生細胞外基質，導致細胞外基質沉積，巨噬細胞分泌的轉化誘導因子β1、白細胞介素等還能夠維持成纖維細胞的增殖與分化[9-10]。除巨噬細胞外，肝臟中的自然殺傷(NK)細胞和NKT細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等對肝星狀細胞的活化、增殖亦起著重要的調控作用[11]。總之，免疫細胞在損傷因子的刺激下，產生各種免疫因子，并通過刺激肝星狀細胞，進而影響肝纖維化，在肝纖維化的發生與發展中發揮著重要作用。降低促纖維化免疫因子分泌、增加抑制纖維化免疫因子分泌，可能是防治肝纖維化的一個新的契機。中醫藥對機體免疫調節具有很好的療效，深入研究其與免疫調節的作用及機制具有重要意義。

王磊等[12]利用清熱利濕的茵陳蒿湯治療二甲基亞硝胺誘導的大鼠肝纖維化，發現其能夠有效逆轉大鼠肝纖維化,證實二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化大鼠的主要中醫方證為濕熱、瘀熱內蘊兼氣虛，因此，本研究在制備肝纖維化模型時采用二甲基亞硝胺進行腹腔注射。結果顯示，模型組大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平明顯升高，細胞外基質增加，肝臟出現纖維化、提示二甲基亞硝胺誘導肝纖維化模型成功，α-SMA表達表達增加證實肝星狀細胞活化在二甲基亞硝胺誘導肝纖維化的形成中發揮了重要作用。模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高，證實在二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化大鼠中存在著免疫系統功能紊亂，TNF-α、IL-1β與肝纖維化分級正相關，與肝纖維化血清學標志物HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平正相關，與肝α-SMA、Vimentin的表達正相關，提示TNF-α、IL-1β在肝纖維化的發生、發展中發揮著重要作用，具體機制可能為促進肝星狀細胞的增殖與活化，使細胞外基質降解減少，生成增加，最終導致肝纖維化。矮地茶黃酮高、中劑量組大鼠肝臟纖維化明顯得到改善，膠原纖維生成較少，活化的肝星狀細胞亦低于模型組，肝纖維化標志物HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平降低，均提示矮地茶黃酮對二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化有較好的防治作用。矮地茶黃酮低劑量組大鼠肝臟纖維化改善不明顯，膠原纖維生成、肝星狀細胞活化、肝纖維化標志物HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平較模型組變化不明顯，亦提示矮地茶黃酮對二甲基亞硝胺誘導肝纖維化的防治作用與劑量有關。治療組中，TNF-α、IL-1β水平低的大鼠，其肝纖維化級別也較低，肝纖維化標志物HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平降低，Vimentin的表達水平降低，肝星狀細胞活化的標志物α-SMA表達水平亦降低，提示矮地茶黃酮能通過降低固有免疫細胞因子TNF-α、IL-1β水平，影響機體免疫功能，進而抑制肝星狀細胞增殖與活化，使細胞外基質降解增加、生成減少，進而阻止肝纖維化的發生與發展。