流式細胞術檢測CD161對結核病的診斷效能*

陳 騎，楊倩婷，張明霞，康 紅

深圳市第三人民醫院肝病研究所，廣東深圳 518112

結核病仍然是當前危害人類健康最嚴重的傳染病之一。造成結核病流行的現狀有多個方面的原因，其中缺乏快速、有效的早期結核感染診斷技術是重要原因之一。因此，結核分枝桿菌(TB)早期診斷對結核病防治具有重要意義。本文利用流式細胞儀檢測全血細胞中CD161的表達，并與現有結核病診斷的實驗室方法進行對比，評價其在臨床應用的效能。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院收治的活動性肺結核患者178例作為結核病組。其中男126例，女52例，年齡(52.32±1.34)歲。根據臨床癥狀、胸部X線、抗酸桿菌痰涂片、痰結核菌培養及對抗結核治療反應等診斷為活動性肺結核，均接受抗結核治療。另選取本院體檢健康者138例作為健康對照組。男97例，女41例，年齡(52.61±1.27)歲，均經胸部X線拍片或者CT檢查，排除肺部結核及肺外其他部位結核，既往無結核病史，無服用過抗結核藥物。

1.2儀器與試劑 7500型PCR儀購自ABI公司，全自動熒光定量PCR儀Cepheid 工作站購自美國賽沛公司，斑點Elispot讀板儀購自美國CTL公司，Canto Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司。TB-DNA核酸檢測試劑盒(批號：20191001)購自達安基因股份有限公司，GeneXpert檢測試劑盒(批號：1000166969)購自深圳市同春和生物科技有限公司，IGRAs試劑盒(批號：20190800905)購自北京同生時代生物科技有限公司，流式細胞術CD161試劑盒(批號：20190901)購自深圳市聯合醫學科技有限公司；全血用紅細胞裂解液及抗 CD3(SY7)、抗CD4(SY3)、抗 CD45(2D1)購自美國BD公司，抗CD161(191B8)購自美國Beckman Coulter公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集兩組研究對象肝素鋰抗凝外周血，采用于流式細胞儀檢測CD161。收集活動性肺結核組患者清晨痰液標本，并進行痰涂片、TB-DNA等檢測。

1.3.2全血細胞染色及流式細胞術分析 取100 μL全血用紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心后收集細胞，采用抗 CD3、抗CD4、抗 CD45和抗CD161等抗體進行表面染色，室溫避光孵育 15 min后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍并進行流式細胞儀檢測。分析單核細胞百分比、淋巴細胞百分比、淋巴細胞CD161百分比，計算各標本的RF值。RF值=淋巴細胞百分比/單核細胞百分比×淋巴細胞CD161百分比。

2 結 果

2.1CD161對活動性肺結核的診斷效能 結核病組患者RF值(127.9±8.6)低于健康對照組(224.2±8.3)，差異有統計學意義(P<0.001)。為進一步明確CD161分辨結核患者和健康對照者的效能，繪制ROC曲線，結果顯示其曲線下面積(AUC)為0.80。當RF值<150時，靈敏度為72.47%，特異度為71.01%。

2.2CD161檢測方法與其他結核病實驗室檢測方法比較 現有的結核病常規檢查方法主要包括CD161檢測技術、痰涂片、GeneXpert、TB-DNA、γ-干擾素釋放試驗(IGRAs)，其檢測陽性率分別為72.47%(129/178)、33.33%(53/159)、50.34%(74/147)、40.62%(52/128)、67.46%(85/126)。

2.3不同方法學在菌陽、菌陰性肺結核患者中檢測效率比較 根據痰涂片結果將結核患者分為菌陰性肺結核患者(77例)和菌陽性肺結核患者(53例)，進一步比較GeneXpert、TB-DNA、IGRAs、CD161檢測方法的陽性率，結果顯示在菌陽性肺結核結合患者中，GeneXpert檢測陽性率最高，在菌陰性肺結核患者中，CD161檢測技術陽性率最高。見表1。

表1 不同方法學檢測在菌陽、菌陰性肺結核患者中的檢測效率比較

3 討 論

結核病在傳染性疾病中病死率排名第一，也是世界第九大死因疾病。自2018年以來，結核病病死率進一步增加，其中以人類免疫缺陷病毒(HIV)合并TB感染為主，耐多藥結核其次。結核病控制最有效的方法是早期診斷和干預，但缺乏簡單、經濟、有效的診斷工具會妨礙結核病的準確檢測。據報道，近1/3 HIV感染者合并TB感染，合并感染攜帶者更易發展為活動性肺結核[1]。早期發現和診斷對防控結核病傳播尤為關鍵。目前結核病的診斷實驗室方法主要有 GeneXpert、痰涂片、TB-DNA及IGRAs等，但這些方法在診斷目前還不能完全滿足臨床的需要。GeneXpert可快速診斷結核病并且可以檢測利福平耐藥性，并且在菌陽性肺結核患者中的陽性率比較高，在本研究中，53例菌陽性肺結核患者中GeneXpert檢測的陽性率為97.96%。然而，該方法無法區分死細菌和活細菌中的DNA[2]?？顾釛U菌痰涂片方法無法區分TB與其他抗酸桿菌，并且當每毫升痰液的細菌載量少于10 000個細菌時，靈敏度大大降低[3]；TB-DNA、IGRAs方法則無法區分活動性肺結核患者和潛伏感染者[4]。另外，在本研究的138例健康人群中，同時用IGRAs和CD161方法檢測的效能相當，IGRAs目前是健康人群是否結核病潛伏感染的常用方法，但受其細胞免疫影響，手工操作繁瑣等，使得檢測結果時間較長。

CD161是C型凝集素樣受體，可由多種細胞表達，這些細胞包括CD4+T細胞、CD8+T細胞、γδ+T細胞、自然殺傷(NK)細胞、與黏膜相關T(MAIT)細胞[5]。表達CD161分子的細胞在抗EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)以及流感病毒等微生物免疫方面有重要作用[6]。但是其參與了類風濕關節炎、多發性硬化癥、克羅恩病及原發性干燥綜合征等自身免疫性疾病的病理過程[7-10]。CD161分子被認為是輔助性T細胞17(Th17細胞)的標志物[11-12]，Th17細胞分泌的白細胞介素17A(IL-17A)和IL-17F兩種前炎癥因子在結核菌清除起到重要作用[13]。因此，流式細胞術檢測CD161方法在結核病的診斷中具有重要意義。本研究中，流式細胞術檢測CD161方法可有效鑒別活動性肺結核患者與健康對照者，與已發表的研究一致[5]。在判斷結核病患者和健康對照者的靈敏度和特異度均為72%左右。在菌陽、菌陰性肺結核患者中流式細胞術檢測CD161方法檢測陽性率明顯高于GeneXpert、TB-DNA及IGRAs方法，且CD161方法更適用于對菌陰性肺結核患者的診斷。

另外，利用流式細胞術檢測CD161的方法有其顯著的優勢：(1)該技術檢測標本是外周血，與GeneXpert、TB-DNA等檢測標本痰液相比，CD161方法檢測不受標本限制；(2)檢測用血量少(1 mL)，有利于在老年人或兒童等特殊場景的中應用；(3)檢測方法簡便、操作步驟容易掌握，有利于臨床推廣；(4)檢測時間短，1 h即可出結果。

綜上所述，利用流式細胞術檢測CD161對活動性肺結核有很高的診斷價值，可用于健康人群的體檢篩查。