土貝母含藥血清對人肺癌細胞增殖和凋亡的影響

米衛國,張 偉,劉建軍,張昭鵬

陜西省漢中市中心醫院胸外科，陜西漢中 723000

肺癌是世界上最常見的癌癥之一，也是癌癥致死的主要原因，5年生存率僅為10%～20%[1-2]，嚴重影響人類生命健康。然而，用于治療和預防肺癌的傳統化療往往伴隨不良反應和耐藥性發生。因此，發掘出一種成本低、不良反應小、易于獲得的新的治療藥物意義重大[3]。傳統中藥含有豐富的生物活性成分，通過靶向與疾病相關的多種分子網絡發揮作用。因此，傳統中藥是可以開發用于預防和治療癌癥的潛在候選藥物。土貝母是一種傳統中草藥，又名假貝母、地苦膽、草貝，為葫蘆科土貝母屬植物的干燥塊莖。性味苦、微寒，歸肺、脾經，有散結、消腫、解毒之功能，原載于清代趙氏所編《本草綱目拾遺》，曾用于乳癰、瘰疬、乳腺炎等。近年來，有研究報道，土貝母具有一定的抗腫瘤作用[4]，但既往研究都只局限于針其單體化合物活性的評價。本研究從土貝母提取物整體著手，通過制備土貝母含藥血清，進一步深入評價傳統中草藥土貝母對肺癌的抗腫瘤活性，為指導臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料 土貝母購自老百姓大藥房連鎖股份有限公司；雄性SD大鼠(SPF級)60只，體質量(200±10)g，購自中國人民解放軍空軍軍醫大學實驗動物中心[實驗動物生產許可證號：SCXK(軍)2012-0007]；人肺癌A549和H1299細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)；Gibco胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司；DMEM-高糖型細胞培養基購自Hyclone公司，雙抗(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶[含乙二胺四乙酸(EDTA)]購自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；兔抗裂解型胱天蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)抗體、兔抗Cleaved-Caspase-8、兔抗Cleaved-Caspase-9、兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗β肌動蛋白(β-actin)抗體均購自美國Bioworld Technology公司；細胞蛋白提取試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 采用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的DMEM-高糖型培養液，于CO2濃度為5%、溫度為37 ℃的細胞培養箱中培養人肺癌A549細胞和H1299細胞，待細胞呈對數生長期時進行實驗。

1.2.2實驗藥物的提取 取中藥材土貝母置于中藥煎鍋中，加入4倍量水常溫浸泡30 min，再加熱至沸騰，煎煮30 min，過濾收集濾液。濾渣再次加入2倍量水，加熱至沸騰，煎煮30 min，稍冷后趁熱過濾，收集下層濾液。濾渣再次加入2倍量水，加熱至沸騰，再次煎煮30 min，稍冷后趁熱過濾，棄去濾渣，收集濾液，合并2次濾液。旋轉蒸發儀濃縮藥液，最終獲得相當于含土貝母生藥材質量濃度為1.5 g/mL的水煎液，分裝并密閉保存于-20 ℃冰箱備用[4]。

1.2.3土貝母含藥血清的制備 將健康雄性SD大鼠隨機分為土貝母組和正常對照組，各10只，灌胃給藥前各組大鼠禁食、不禁飲18 h，按照8 g/kg生藥劑量給予大鼠灌胃，正常對照組灌胃等體積生理鹽水。每日分早、晚2次給藥，間隔時間為10 h，連續灌胃給藥3 d，正常飲食、飲水。在第4天第1次大鼠灌胃土貝母提取液1 h后，麻醉大鼠，剖開腹部，在腹主動脈采血，室溫靜置0.5 h，在5 000 r/min轉速下離心10 min，收集上層血清，即得土貝母水煎液含藥血清。同組大鼠含藥血清合并混勻，在56 ℃水浴條件下滅活30 min。采用0.22 μm無菌微孔濾膜，在無菌條件下進行過濾，收集濾液，無菌封裝，于-20 ℃冰箱保存備用。實驗時，采用細胞培養液稀釋后使用。

1.2.4MTT法檢測土貝母含藥血清對人肺癌細胞增殖的影響 消化、收集人肺癌A549和H1299細胞，以1×104個/孔細胞密度接種于96孔板中，分為11組，每組設置6個復孔，置細胞培養箱中培養24 h后，移去細胞培養液，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次。對照組細胞更換新鮮培養液，給藥組細胞更換含有2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、40.0%含藥血清的培養液，以相應濃度的無藥血清(10%血清)作為陰性對照組。將96孔板置細胞培養箱中孵育24 h。每孔加入濃度為5 mg/mL的無菌MTT溶液20 μL，在細胞培養箱中繼續孵育3 h，棄去每孔上清液，再依次每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液200 μL，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定每孔的吸光度(A)值，計算每組細胞A值的平均值，實驗重復3次。采用下列公式計算相對增殖率。細胞相對增殖率(%)=(A給藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.2.5土貝母含藥血清對人肺癌細胞Ki67表達水平的影響 采用免疫熒光方法檢測土貝母含藥血清處理人肺癌細胞中Ki67相對表達量的變化。消化、收集人肺癌A549和H1299細胞，接種于無菌24孔板中(含有細胞爬片)，細胞密度為1×105個/孔。培養24 h后，棄去上清液，更換含有10% 土貝母含藥血清的培養液孵育細胞，以相應濃度的無藥血清(10%血清)作為陰性對照組，各組細胞繼續孵育24 h。次日，棄去上清液，用PBS漂洗3次，棄去PBS，室溫下用4%多聚甲醛固定10 min。PBS漂洗3次去除多余甲醛。每孔加入0.05% 的Triton X-100溶液400 μL，室溫條件下孵育30 min，用PBS漂洗3次后，棄去PBS。每孔滴加山羊血清封閉液300 μL，室溫孵育30 min后，棄去封閉液，不洗，每孔細胞爬片上滴加稀釋的Ki67抗體(1∶1 000)，放入濕盒，37 ℃條件下孵育1 h。采用PBST洗3次，每次3 min。再滴加熒光二抗于各組細胞爬片上，室溫避光條件下孵育30 min。避光條件下用PBST洗3次，每次5 min，再加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液，室溫避光條件下孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。避光下從24孔板中取出各組細胞爬片，用抗熒光淬滅封片劑避光條件下封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，統計Ki67相對表達量。

1.2.6流式細胞術檢測土貝母含藥血清對人肺癌細胞凋亡的影響 根據MTT試驗結果，選用5.0%和10.0%濃度的土貝母含藥血清處理肺癌細胞，流式細胞術檢測肺癌細胞凋亡情況。消化、收集人肺癌A549和H1299細胞，接種于6孔板中，細胞密度為5×105個/孔，常規培養24 h后，棄去每孔培養液并用無菌PBS漂洗3次。分別加入新的含有濃度為5.0%和10.0%土貝母含藥血清的培養液孵育細胞24 h，以相應濃度的無藥血清作為陰性對照組。24 h后消化收集各組細胞，各組細胞用PBS漂洗3次，每組樣品用195 μL的Annexin V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)結合緩沖液(10 mmol/L HEPES/NaOH,140 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L CaCl2)重懸細胞。各組樣本中加入濃度為25 μg/mL的Annexin V-FITC結合緩沖液5 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。離心5 min，收集細胞沉淀并加入190 μL Annexin V-FITC結合緩沖液重懸細胞。再加入10 μL的碘化丙錠(PI)溶液(250 μg/mL)輕輕混勻。立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7Western blot試驗檢測土貝母含藥血清對人肺癌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響 消化、收集人肺癌A549和H1299細胞，接種于直徑為10 cm培養皿中，細胞密度為5×105個/孔，加入細胞培養液10 mL在培養箱中培養24 h。次日，棄去培養液，PBS洗2次，分別加入新的含有濃度為5.0%和10.0%土貝母含藥血清的培養液孵育細胞24 h，以相應濃度的無藥血清作為陰性對照組。24 h后消化收集各組細胞，每組細胞樣本在冰浴中加入蛋白裂解液200 μL，裂解30 min。在4 ℃低溫13 000 r/min轉速下，離心20 min，收集上清液、棄去沉淀，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。各組以40 μg蛋白量上樣，在6 %濃縮膠、12%分離膠上進行SDS-PAGE電泳、轉膜。采用10%脫脂奶粉封閉2 h，按照常規滴加一抗(Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9、Bax、Bcl-2、β-actin，1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，室溫復溫2 h，PBST洗膜3次，每次5 min。然后加入羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。PBST洗膜3次。采用化學發光方法，通過凝膠化學發光儀拍照，灰度掃描，以β-actin為內參。結果以β-actin比值進行統計分析，檢測土貝母含藥血清對人肺癌細胞中Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響。

2 結 果

2.1土貝母含藥血清對人肺癌細胞增殖的影響 MTT檢測結果顯示，土貝母含藥血清明顯抑制人肺癌A549和H1299細胞的增殖，并呈一定劑量依賴性。與對照組比較，5.0%、10.0%、20.0%、40.0%的土貝母含藥血清對人肺癌A549細胞增殖抑制率分別為(10.65±2.56)%、(20.22±2.55)%、(28.48±2.49)%和(32.72±3.35)%，對H1299細胞增殖抑制率分別為(9.51±2.51)%、(16.05±2.63)%、(26.67±3.90)%和(30.87±4.71)%，土貝母含藥血清對人肺癌A549和H1299細胞增殖抑制作用明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2土貝母含藥血清處理人肺癌A549和H1299細胞Ki67相對陽性表達率 給予人肺癌細胞土貝母含藥血清處理后，人肺癌細胞中Ki67的陽性表達率明顯下降，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

注：A為肺癌細胞中Ki67免疫熒光染色；B為Ki67相對表達率。與對照組比較，*P<0.05；NS表示與對照組比較，P>0.05。

注：A為流式細胞術檢測肺癌A549細胞凋亡情況及細胞凋亡率的半定量分析；B為流式細胞術檢測肺癌H1299細胞凋亡情況及細胞凋亡率的半定量分析。與對照組比較，*P<0.05；NS表示與對照組比較，P>0.05。

注：A為Western blot試驗檢測人肺癌A549細胞中凋亡相關蛋白的表達；B為蛋白表達半定量分析。與對照組比較，*P<0.05,NS表示與對照組比較，P>0.05。

2.3土貝母含藥血清誘導人肺癌A549和H1299細胞的凋亡 與對照組比較，土貝母含藥血清處理細胞24 h后肺癌細胞凋亡率明顯升高。其中5.0%的土貝母含藥血清處理后，人肺癌A549和H1299細胞凋亡率分別為(9.23±0.70)%和(10.50±1.21)%，10.0%的土貝母含藥血清處理后，人肺癌A549和H1299細胞凋亡率分別為(15.57±1.20)%和(18.83±2.12)%，與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.4土貝母含藥血清對人肺癌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，不同濃度土貝母含藥血清處理細胞后，肺癌細胞中Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9及Bax的表達水平明顯升高，Bcl-2表達水平明顯下降，對Cleaved-Caspase-8表達無影響。差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3、4。

注：A為Western blot法檢測人肺癌H1299細胞中凋亡相關蛋白的表達；B為蛋白表達半定量分析。與對照組比較，*P<0.05；NS表示與對照組比較，P>0.05。

3 討 論

肺癌是全球常見惡性腫瘤之一，其發病率和致死率居高不下，并呈逐年上升及年輕化趨勢。目前，臨床治療肺癌常見方法仍然以手術聯合放療和化療為主，但是肺癌對傳統化療藥物有強抗藥性，化療有效率低，并且通常還伴有一系列并發癥和嚴重不良反應，導致患者免疫功能下降、身體衰弱、炎性反應等[6]，嚴重影響肺癌患者治療后的生活質量。

中藥治療癌癥作為我國獨特的治療方式，以中醫理論為指導，從整體辨證施治而形成。能充分體現出在腫瘤治療中的個性化、多靶點、多層次治療原則[7-8]，且其低毒、有效、價格低廉等優勢，在臨床治療多種疾病中療效明顯[9]。中醫認為，肺癌是由于邪愈盛而正愈虛，本虛標實，病變錯綜復雜，病勢日益深重。肺癌之本虛以陰虛、氣陰兩虛多見，標實以氣阻、瘀血、痰濁多見，以致癌毒內積。土貝母性味苦、微寒、歸肺、脾經，有散結、消腫、解毒之功能，近年來研究表明，其單體化學成分有明顯的抗腫瘤活性[5]。而中藥中單體化學成分不能完全代表其在體內發揮作用的有效物質形式[10]。因此，中藥血清藥理學實驗方法為中藥藥理學的體外研究提供了可行性，能夠反映中藥在體內發揮的藥效作用，明確其作用機制[11]。

本研究采用不同濃度土貝母含藥血清處理人肺癌A549和H1299細胞，MTT結果表明，土貝母含藥血清對人肺癌A549和H1299細胞增殖呈現一定劑量依賴性的抑制作用。Ki67是與細胞增殖密切相關的核抗原，其在腫瘤細胞中表達陽性率相對越高，提示細胞的增殖能力越強。免疫熒光結果顯示，與對照組比較，土貝母含藥血清處理的人肺癌細胞中Ki67蛋白水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，表明土貝母含藥血清對人肺癌A549和H1299細胞的增殖具有顯著抑制作用(圖1)。流式細胞術檢測人肺癌A549和H1299細胞給予土貝母含藥血清處理后，肺癌細胞凋亡率顯著升高(圖2)，提示土貝母含藥血清可誘導人肺癌A549和H1299細胞的凋亡。增殖的不可控和抗凋亡是腫瘤細胞惡性進展過程中的重要特征，細胞凋亡途徑主要有線粒體和死亡受體發生的凋亡，Caspase家族成員在調節細胞凋亡過程中發揮重要作用[12]。Caspase-3是其重要成員之一，是細胞凋亡的“執行者”，其受Caspase-8介導的細胞死亡受體途徑和Caspase-9介導的細胞線粒體途徑的細胞凋亡過程[13]。因此，為進一步探討土貝母水提物含藥血清誘導人肺癌A549和H1299細胞的凋亡的可能作用機制，本研究采用Western blot試驗檢測給予土貝母水提物含藥血清處理的人肺癌A549和H1299細胞中凋亡相關蛋白表達的變化。結果表明，土貝母水提物含藥血清處理的肺癌細胞中Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3的表達水平顯著升高，并顯著增加促凋亡蛋白Bax的表達水平，顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，對Cleaved-Caspase-8表達無顯著影響。結果表明，土貝母水提物含藥血清可能通過影響人肺癌細胞中Caspase介導的線粒體凋亡途徑誘導其凋亡，發揮抑制肺癌細胞增殖的作用。

本研究探討了土貝母水提物含藥血清誘導肺胃癌細胞凋亡的作用，初步探討其可能的作用機制，結果表明土貝母水提物含藥血清體外抗肺癌作用顯著，其可能是通過影響人肺癌細胞中Caspase介導的線粒體凋亡途徑誘導其凋亡。本研究結果為土貝母是否可作為治療肺癌的進一步深入研究和指導臨床用藥提供了新思路。