維生素D3及其代謝物對成骨細胞分化及生物礦化的實驗研究

汪東 楊媛 張崢 田天 周家寧 譚榮 周雪峰 王蒙

解放軍戰略支援部隊特色醫學中心骨科，北京 100101

人體骨骼的形成和重塑需要多種細胞的協作，其中成骨細胞發揮了至關重要的作用。成骨細胞可調節骨的礦化，其與破骨細胞的動態平衡直接影響骨的生物學特性[1]。維生素D作為一種脂溶性維生素，在調節成骨細胞和骨形成中起著至關重要的作用[2-3]。人體中的維生素D主要是維生素D3(VD3)，其代謝產物25-羥基維生素D3[25(OH)VD3]在血清中的濃度是體內維生素D的最可靠指標，有研究證實骨質疏松和骨折與25(OH)VD3的血清濃度不達標狀態密切相關[4]，25(OH)VD3在腎中通過1α羥基化作用產生活性形式的1α,25-二羥基維生素D3[1α,25(OH)2VD3]，作為VD3最活躍的形式，它通過維生素D受體(VDR)發揮作用。許多研究報道，維生素D3的代謝產物25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3可以在體外和體內調節不同類型細胞的功能[5-7]。例如，Lou等[5]的研究表明25(OH)VD3在較高的生理濃度下作為一種活性激素參與VD3應答基因調控和抑制細胞增殖。亦有研究證實VD3代謝物可誘導間充質干細胞(MSCs)的成骨分化[7]。然而目前VD3及其代謝物對成骨細胞分化的影響尚不清楚。基于推測VD3及其代謝物可能對成骨細胞的分化和生物礦化起促進作用。本研究通過檢測細胞增殖、成骨相關基因表達、蛋白分泌和生物礦化等研究VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3對成骨細胞的影響，以期進一步了解VD3及其代謝物在促進成骨細胞分化和生物礦化中的作用和關系，為其在臨床骨質疏松癥和骨組織工程中的應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

DMEM細胞培養液、胎牛血清(美國Gibco公司)；碳酸氫鈉、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、EDTA、PBS、VD3、25(OH)VD3、1α,25(OH)2VD3(美國Sigma公司)；堿性磷酸酶測定試劑盒、總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(中國Beyotime生物技術公司)；CCK-8檢測試劑盒 (日本Takara公司)；骨鈣素ELISA檢測試劑盒(美國Zymed公司)

1.2 儀器

CO2細胞培養箱 (美國Thermo公司)；分光光度計(美國 Beckman公司)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；定量PCR儀(美國Stratgenes 公司)；臺式低溫高速離心機(美國Thermo公司)；Millipore純水系統(美國 Millipore 公司)。

1.3 成骨細胞培養

采用膠原酶消化法分離成骨細胞，取1 d齡新生大鼠顱骨，制成 1～3 mm3的骨粒，0.25 % 的胰蛋白酶消化清除纖維組織細胞，在0.1 % 膠原酶Ⅱ、37 ℃環境下振蕩消化50 min，收集消化液，室溫下以1 200 r/min離心10 min，去除上清液，接種于培養瓶中，對靜置后沉淀部分可再重復以膠原酶消化20 min、磁力攪拌消化15 min、離心10 min，添加含10 %胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、1.5 mg/mL碳酸氫鈉和0.33 mg/mL L-谷氨酰胺的DMEM培養基。將獲得的細胞放置于二氧化碳培養箱，在5 % CO2，95 %空氣，37 ℃溫度下培養，24 h后可見細胞貼壁生長，胞質開始伸展，換新鮮培養液，以后每隔48 h換培養液。當細胞聚集度達到90 %左右時，用0.25 %胰蛋白酶消化傳代。第三代細胞被用于體外研究。

1.4 實驗分組

分為正常細胞對照組，VD3藥物處理組，25(OH)VD3藥物處理組和1α,25(OH)2VD3藥物處理組，我們以50～200 nmol/L作為維生素D3和25(OH)VD3的實驗濃度，1α,25(OH)2VD3的實驗濃度為0.01～0.2 nmol/L。成骨細胞接種密度為3 000細胞/cm2，培養1 d，細胞貼壁后更換含VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3的藥物處理培養基，每周換液3次，常規細胞培養。

1.5 CCK-8細胞增殖檢測

成骨細胞接種于24孔板，初始密度為1*104細胞/cm2，藥物處理第7天用PBS沖洗3次，配置含10 %CCK-8的培養基，以換液的形式加入，37 °C孵育2 h，用分光光度法測定波長450 nm處的吸光值。

1.6 堿性磷酸酶活性測定

成骨細胞接種于24孔板，接種密度為1*104細胞/cm2，藥物處理7 d，收集細胞用1 %TritonX-100進行3次凍融處理，經離心后，按ALP 試劑盒說明，采用對硝基苯磷酸二鈉基質動力學法 (PNPP 法) 測定ALP 活性，Bradford 法測定細胞液蛋白濃度，ALP 活性用細胞內總蛋白濃度校正。

1.7 鈣含量測定

將成骨細胞接種于24孔板中，初始密度為1*104細胞/cm2。培養21 d后，細胞用4 %多聚甲醛固定并在室溫下用茜素紅S(ARS) (40 mmol/L，pH=4.1)染色，收集細胞，在85 °C下加熱10 min，離心15 min后，收集上清液，加入10 %氫氧化銨中和酸，測量450 nm波長處吸光度值。

1.8 ELISA測定骨鈣素濃度

收集藥物處理21 d的細胞，PBS洗滌一次，用含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析緩沖液進行裂解。使用Gla型骨鈣素EIA試劑盒檢測，稀釋細胞裂解物，確保ELISA測定的樣品讀數在標準范圍內(0～16 ng/mL)。細胞裂解液中的蛋白質濃度用 BCA蛋白分析試劑盒測定。450 nm波長處測定吸光度。根據標準品吸光度曲線測定骨鈣素濃度(以pg/mL表示)。

1.9 成骨細胞標志基因表達

收集藥物處理7 d的細胞，用EZNATM總RNA試劑盒II提取總RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒去除基因組DNA和cDNA合成。采用real-time PCR法檢測OCN、Runx2、CYP27B1、CYP24A1表達，β-actin為參照基因。β-actin引物序列為：上游引物5’-GGAGATCTCTGCTCTTA-3‘和下游引物5’用ACTCATCGCTCCTCTTCTGCTG-3’。CYP24A1：上游引物5’-GCCGCCGGGAACTC-3‘和下游引物5’-AAATACCACC。CYP27 B1：上游引物5’-TTGCGAGCGCGACTGTAT-3‘和下游引物5’-TGTGTGATAGCTGGCCACAA-3’；Runx 2：上游引物5’-GCCG TAGAGGGGAAGAC-3‘和下游引物5’-CTGCTTG GATTAGGAGTCAC-3’；OCN：上游引物5’-GAGGGTAAGGGGGGAA-3‘和下游引物5’-TCCTCGTGGAAGCCAATGTG-3’。

反應條件：98 °C 3 min，45個循環的 98 °C 10 s，58 °C 15 s和72 °C 30 s。real-time PCR采用Beyotime生物工程有限公司的 SYBR 染料法試劑盒在美國 ABI公司的 7500 型熒光定量 PCR 儀上進行，采用 2-ΔΔCt 計算基因表達的倍數差異。

1.10 圖像與統計分析

所有數據均以均值±標準差表示。兩組間差異顯著性檢驗使用非配對Studentt檢驗，兩組以上數據比較時使用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗顯著性差異。使用OriginPro 2016進行單因素方差分析和t檢驗統計分析。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖

采用CCK-8法定量評價VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3對成骨細胞增殖的影響。結果表明200 nmol/L VD3處理組的細胞增殖顯著高于50 nmol/L VD3處理組，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3濃度的增加，成骨細胞增殖活性有所增強，但差異沒有統計學意義 (圖1)。結果表明，VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3對成骨細胞均無細胞毒性，只有200 nmol/L VD3對成骨細胞有顯著的促進增殖作用。

注：*P<0.05。圖1 CCK-8法檢測VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3處理7 d的成骨細胞增殖情況Fig.1 The proliferation of osteoblasts treated with VD3,25(OH)D3,or 1α,25(OH)2VD3 for 7 days was detected with CCK-8 method

2.2 成骨細胞24-羥化酶和1α-羥基化反應

在本研究中，我們首先研究成骨細胞是否對VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3有反應。24-羥化酶由CYP24A1編碼，受配體結合VDR調節。既往研究表明，CYP24A1是1α,25(OH)2VD3上調最多的基因，是公認的VDR 敏感靶基因[8-9]。如圖2所示，隨著VD3濃度的增加，CYP24A1的mRNA表達無明顯變化。200 nmol/L 25(OH)VD3處理細胞后，CYP24A1 mRNA水平明顯升高，與100 nmol/L和50 nmol/L相比，差異具有統計學意義(P<0.001；圖2)。0.2 nmol/L 1α,25(OH)2VD3與0.01 nmol/L和0.05 nmol/L 相比，CYP24A1的mRNA水平顯著升高(P<0.001)。低濃度VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3對成骨細胞CYP24A1 mRNA表達水平無明顯影響。

注：***P<0.001。圖2 qRT-PCR法檢測CYP24A1基因的表達Fig.2 CYP24A1 mRNA expression was detected with qRT-PCR

在體內，25(OH)VD3經25-羥基維生素D-1α-羥化酶(CYP27B1)轉化為1α,25(OH)2VD3[9]。因此，我們在培養第7天測定了CYP27B1的mRNA表達，以確定25(OH)VD3是否在成骨細胞中代謝為1α,25(OH)2VD3。如圖3所示，VD3和25(OH)VD3濃度的增加不影響成骨細胞CYP27B1 mRNA的表達。結合圖2的結果，我們可以得出結論：成骨細胞對25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3有反應，但不能直接代謝VD3和25(OH)VD3。

圖3 qRT-PCR法檢測CYP27B1 mRNA表達Fig.3 CYP27B1 mRNA expression was detected with qRT-PCR

2.3 堿性磷酸酶活性測定

ALP的表達是成骨分化的標志[2-3]。定量測定結果顯示(圖4)，與對照組相比，VD3處理組ALP活性無明顯提高。100 nmol/L 25(OH)VD3處理組ALP活性顯著高于50 nmol/L處理組(P<0.05)，200 nmol/L 25(OH)VD3處理組ALP活性最高(P<0.05或P<0.001)。與第7天的其他濃度相比，0.2 nmol/L 1α,25(OH)2VD3處理組ALP活性顯著升高(P<0.01或P<0.001)。結果表明，一定濃度的25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3能促進成骨細胞早期分化。

2.4 鈣含量測定

ARS法檢測細胞外鈣沉積，是晚期成骨分化指標[11]。定量測定結果(圖5)表明，VD3和1α,25(OH)2VD3在任何濃度下都不能顯著促進成骨細胞的生物礦化。僅25(OH)VD3可以促進成骨細胞的生物礦化，當25(OH)VD3濃度增加到200 nmol/L時，細胞的生物礦化水平最高(P<0.01或P<0.001)。

2.5 成骨細胞標志基因表達

Runx2是成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，調節下游成骨基因的轉錄，如ALP、OCN等[12-13]。OCN是最豐富的骨特異性非膠原蛋白，也是反映成骨成熟和骨形成的標志物之一[14-15]。所有實驗組中VD3對Runx2和OCN的表達無明顯影響。與對照組相比，25(OH)VD3處理組可顯著上調Runx2和OCN的表達水平(P<0.01或P<0.001)。1α,25(OH)2VD3處理組對Runx2表達的影響趨勢相似(P<0.05或P<0.001)。但是，1α,25(OH)2VD3處理組成骨細胞的OCN表達水平差異無統計學意義(圖6)。

注：*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。圖4 VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3處理后，成骨細胞的堿性磷酸酶活性測定Fig.4 ALP activity of osteoblasts after treatment with VD3,25(OH)VD3 and 1α,25(OH)2VD3

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖5 VD3、25(OH)VD3、1α,25(OH)2VD3處理成骨細胞21 d鈣含量測定Fig.5 Determination of calcium in osteoblasts treated with VD3,25(OH)VD3,or 1α,25(OH)2VD3 for 21 days

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖6 qRT-PCR法檢測Runx 2和OCN相關mRNA的表達Fig.6 Runx 2 and OCN mRNA expressions were detected with qRT-PCR

2.6 ELISA測定骨鈣素濃度

ELISA檢測結果顯示，VD3和1α,25(OH)2VD3在任何濃度下都不能顯著促進OCN的分泌(圖7)。200 nmol/L 25(OH)VD3處理組OCN的分泌顯著高于其他各組(P<0.0 1或P<0.00 1)。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖7 ELISA法測定骨鈣素濃度Fig.7 The concentration of osteocalcin was measured with ELISA method

3 討論

骨的形成和重塑需要多種細胞的協作，其中成骨細胞在骨骼發育和骨損傷修復中起著至關重要的作用。成骨細胞不僅調節骨的礦化，還間接調節破骨細胞的骨吸收功能，它的數量和功能變化直接影響骨的生物學特性。長期以來，藥物治療被認為是最簡單和可靠地促進成骨細胞分化和生物礦化的方式。維生素D作為在骨骼發育上起重要作用的營養物質[2]，除了可以通過飲食獲得，更主要是依賴于紫外照射通過皮膚合成。人體中的維生素D主要是維生素D3，其作為一種脂溶性維生素，本身沒有生物活性，維生素D3的代謝產物是體內的主要活性形式，其在體內的作用是多種多樣的，與鈣平衡和骨骼發育密切相關[1-2]。維生素D及其代謝物在血清中結合維生素D結合蛋白后轉運至肝臟，在肝臟中，維生素D的C-25 端被羥化產生 25-羥基維生素D3[25(OH)VD3]，25(OH)VD3在血中的濃度是體內維生素D狀態的最可靠指標，25(OH)VD3在腎臟中進一步通過1α羥基化作用產生活性形式的1α,25(OH)2VD3，1α,25(OH)2VD3通過與其高親和力維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)的相互作用調節基因轉錄來發揮其大部分的生物學效應。1α,25(OH)2VD3具有調節鈣、磷代謝的活性，其機制已得到廣泛研究[10]。

我們的研究證實VD3對成骨細胞的分化和生物礦化幾乎無幫助，與VD3和1α,25(OH)2VD3相比，僅25(OH)VD3處理后的成骨細胞胞外基質鈣沉積明顯增加。25(OH)VD3作為一種活性激素，在一些類型的細胞[5-6]中不轉化為1α,25(OH)2VD3，二者具有不同的生物學作用。由此，我們推測，25(OH)VD3對成骨細胞分化和生物礦化的積極影響不是由1α,25(OH)2VD3介導的，因為成骨細胞中CYP27B1的mRNA表達幾乎不隨25(OH)VD3濃度的增加而改變。同樣地，VD3也不能使成骨細胞中CYP24A1的mRNA表達顯著上調，因此，基于上述的研究結果推測VD3不可被成骨細胞代謝，不能對成骨細胞的分化和生物礦化產生明顯的刺激作用。

盡管25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3在誘導hMSCs成骨譜系標志物(Runx2、ALP、OCN等)方面已被證實有效[12-15]，但VD3，25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3對成骨細胞分化的潛在作用仍不清楚。本研究中，我們發現25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3可以劑量依賴性的方式促使早期成骨標志物(Runx2、ALP等)的表達，而只有25(OH)VD3能促進成骨細胞OCN基因和蛋白的表達，提高成骨細胞的生物礦化水平。25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3可以促進Runx2和ALP的表達，這與已報道的部分研究略有不同[16-17]。差異的產生可能是由于1α,25(OH)2VD3對成骨細胞分化的影響是通過不同的信號途徑進行的[18]。

在本研究中，我們根據VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3的血清生理濃度選擇了藥物處理濃度。目前對于理想的25(OH)VD3血清水平，國際、國內多數機構和專家認為，25(OH)VD3的血清濃度范圍為75～150 nmol/L,血清濃度低于 50 nmol /L為維生素 D 缺乏，若血清25(OH)VD3濃度超過375 nmol /L則可能出現維生素 D 中毒[19-22]。美國國立衛生研究院NIH的MedlinePlus醫學信息網和美國國家醫學院 IOM食品與營養委員會向公眾推薦25(OH)VD3的最佳濃度分別為75～185 nmol/L和50 nmol/L[23]。因此，我們使用50～200 nmol/L VD3和25(OH)VD3作為研究濃度。我們的研究發現，只有200 nmol/L VD3能顯著促進成骨細胞增殖，而25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3不能顯著促進成骨細胞增殖。體外在該濃度下VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3對成骨細胞無細胞毒性，該結果與既往的相關研究結果是一致的，即血清中25(OH)VD3低于500 nmol/L沒有細胞毒性發生[24-25]。此外，我們發現100～200 nmol/L的25(OH)VD3是誘導成骨的最佳濃度，考慮到成骨是一個長期的生理過程，理化性質更穩定的VD3代謝物更好。既往研究表明，25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3的半衰期分別為2～3周和4 h[26]，這說明25(OH)VD3比1α,25(OH)2VD3更穩定。另外，25(OH)VD3本身的疏水性高于1α,25(OH)2VD3，更易被細胞攝取。

綜上所述，與VD3和1α,25(OH)2VD3相比，25(OH)VD3具有諸多優點，其在成骨分化和骨損傷修復中具有不可或缺的重要作用。進一步探索更精確的25(OH)VD3使用濃度范圍和促進成骨細胞分化的可能機制是十分必要的。我們的研究結果證實25(OH)VD3在100～200 nmol/L范圍內可誘導成骨細胞分化及生物礦化，為其在臨床骨質疏松癥和骨組織工程中的應用提供了依據。