丹參注射液對(duì)骨質(zhì)疏松合并動(dòng)脈粥樣硬化癥小鼠的作用研究

梅凡 涂艷虹

江漢大學(xué)附屬醫(yī)院 武漢市第六醫(yī)院綜合科，武漢 430015

目前，人口老齡化現(xiàn)象越發(fā)嚴(yán)重，老年性疾病也為全世界衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來了日益沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究報(bào)告顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)和動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)兩者的發(fā)病率逐漸升高[1-2]，而且絕經(jīng)后的女性發(fā)病率更高[3]。對(duì)骨質(zhì)疏松和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)二者間存在緊密聯(lián)系，大多數(shù)作用于心血管的藥物對(duì)骨質(zhì)疏松也可產(chǎn)生正向作用，如他汀類降血脂藥可以刺激骨形成[4-5]，對(duì)骨組織具有合成代謝作用。但目前臨床上能增加骨密度、降低骨質(zhì)疏松性骨折較為肯定的心血管藥物僅他汀類降血脂藥，其他藥物還缺少大量的臨床試驗(yàn)結(jié)果。

丹參是我國(guó)臨床常用的傳統(tǒng)中藥，具有改善微循環(huán)、抗氧化、增大血流量等多種功效，其主要活性成分包括丹參酮、丹參素、丹酚酸等，能夠有效預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，丹參的粗提取物可促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和分化[8-9]，還有著促進(jìn)骨折愈合的作用[10]。本研究擬構(gòu)建骨質(zhì)疏松合并動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，采用丹參注射液進(jìn)行治療，通過觀察血脂變化、動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變、骨代謝指標(biāo)和骨結(jié)構(gòu)的變化，評(píng)價(jià)丹參注射液對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化癥的防治作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只6周齡SPF級(jí)雌性未交配C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～20 g，來源于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2018-0104。飼養(yǎng)條件控制溫度在22～26 °C，濕度50 %～60 %。

1.2 主要儀器和試劑

丹參注射液購(gòu)自正大青春寶制藥有限公司(2019031109)；辛伐他汀片購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司(2019020110)；戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma Merck(P3761)；小鼠骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)Elisa kit、骨鈣素(osteocalcin，OC)Elisa kit、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、抗酒石酸酸性磷酸酶5(TARTRate-resistant acid phosphatase5，TRAP5)購(gòu)自Bioswamp(MU30270、MU30420、MU30430、MU30923)；伊紅、中性樹脂、蘇木精購(gòu)自Solarbio(E8090、G8590、G1140)；新型脫鈣液(快脫)購(gòu)自Servicebio(G1107)；二甲苯、碳酸鋰、冰醋酸、無水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(10023418、20022818、10000218、10009218)。

酶標(biāo)儀購(gòu)自Labsystems Multiskan MS(型號(hào)：352 型)；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自邁瑞(型號(hào)：BS-420)；自動(dòng)組織脫水機(jī)購(gòu)自湖北康強(qiáng)(型號(hào)：TKD-TSF)；生物組織包埋機(jī)購(gòu)自泰維科技(型號(hào)：TB-718D)；正置顯微鏡、石蠟切片機(jī)購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)(型號(hào)：DM1000、RM2235)。

1.3 方法

1.3.1模型構(gòu)建：參考陳昱等[12]和楊其波等[13]的方法，采用卵巢摘除并高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建骨質(zhì)疏松合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型；適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，用1 %戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，腹部備皮，仰臥位固定，常規(guī)消毒后鋪巾，沿下腹正中切開，打開腹膜，切除雙側(cè)卵巢，逐層縫合，關(guān)閉腹腔，待小鼠蘇醒后放入飼養(yǎng)籠中。一次性給予維生素D3(60萬U/kg)腹腔注射后，每日喂服高脂飼料20 g(含5 %白糖、81.3 %基礎(chǔ)飼料、0.2 %丙基硫氧嘧啶、10 %豬油、3 %膽固醇、0.5 %膽酸鈉)，喂服45 d。

1.3.2分組和給藥：將小鼠隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、模型組、低劑量丹參組、中劑量丹參組、高劑量丹參組、辛伐他汀組，每組6只。對(duì)照組行假手術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)飼料正常飼養(yǎng)；模型組自造模第30 d開始進(jìn)行蒸餾水灌胃，連續(xù)15 d；低、中、高劑量丹參組造模第30 d開始分別給予0.5、3.0、8.0 mL/(kg·d)丹參注射液腹腔注射，連續(xù)15 d；辛伐他汀組自造模第30 d開始給予0.6 mg/(kg·d)辛伐他汀灌胃，連續(xù)15 d。給藥結(jié)束后，斷頸處死小鼠進(jìn)行取材。

1.3.3病理學(xué)觀察：取出小鼠左側(cè)股骨組織及主動(dòng)脈血管組織。將骨組織放入裝有組織體積10倍左右的快脫脫鈣液容器中，脫鈣后，骨組織對(duì)半縱切，主動(dòng)脈血管組織切取0.3 cm長(zhǎng)度組織，脫水浸蠟包埋，經(jīng)切片、展片、烤片等后進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4Elisa血清檢測(cè)：各組小鼠處死前行腹主動(dòng)脈取血，全血靜置2 h，于3 000 r/min下離心10 min，收集血清。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟測(cè)定小鼠血清中BALP、OC、ox-LDL、TRAP5水平。

1.3.5生化血清檢測(cè)：于4 °C解融血液標(biāo)本后，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠血清中三酰甘油(TRIGLyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein，HDL-C)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；使用Leica Application Suite圖象系統(tǒng)采集樣本相關(guān)部位的圖象并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 丹參注射液對(duì)小鼠左側(cè)股骨組織和主動(dòng)脈血管組織病理形態(tài)的影響

如圖1所示，對(duì)照組小鼠左側(cè)股骨骨小梁豐富均勻，排列整齊，呈現(xiàn)連續(xù)致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；與對(duì)照組比較，模型組小鼠骨小梁明顯減少，結(jié)構(gòu)松散不規(guī)則，部分?jǐn)嗔眩枨粌?nèi)脂滴增多；與模型組比較，丹參各劑量組和辛伐他汀組骨小梁數(shù)量增多，高劑量組和辛伐他汀骨小梁排列緊密，連續(xù)性和完整性較好，髓腔內(nèi)脂滴減少。

圖1 小鼠左側(cè)股骨HE染色(100*)Fig.1 HE staining of the left femur in mice (100*)

如圖2所示，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈三層結(jié)構(gòu)層次清晰，內(nèi)膜光滑完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列致密整齊；與對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈三層結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，多處形成附壁斑塊，泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積并可見顆粒狀鈣化灶；與模型組比較，丹參各劑量組和辛伐他汀組小鼠主動(dòng)脈病變均有不同程度減輕。

圖2 小鼠主動(dòng)脈HE染色(200*)Fig.2 HE staining of the aorta in mice (200*)

2.2 丹參注射液對(duì)小鼠血清中BALP、OC、TRAP5水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中BALP、OC、TRAP5水平顯著上升(P<0.01)；與模型組比較，低、中、高劑量丹參組小鼠血清中BALP、OC、TRAP5水平顯著下降(P<0.01)且呈劑量依賴性。見圖3。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 小鼠血清中BALP、OC、TRAP5水平Fig.3 The serum levels of BALP,OC,and TRAP5 in mice

2.3 丹參注射液對(duì)小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ox-LDL水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TG、TC、LDL-C、ox-LDL水平顯著上升，HDL-C水平顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，低、中、高劑量丹參組和辛伐他汀組小鼠血清中TG、TC、LDL-C、ox-LDL水平顯著下降，HDL-C水平顯著上升(P<0.01)。見圖4。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖4 小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、ox-LDL水平Fig.4 The serum levels of TG,TC,LDL-C,HDL-C,and ox-LDL in mice

3 討論

臨床研究表明，骨質(zhì)疏松與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，患有骨質(zhì)疏松癥老年人群也常伴有動(dòng)脈粥樣硬化[13]。他汀類藥物能夠促進(jìn)骨形成，增加骨密度并減少骨折發(fā)生率，但也在一定程度上對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生不良影響[14-15]。丹參作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，不僅能有效預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化，對(duì)骨細(xì)胞增殖和分化也有一定促進(jìn)作用。本研究構(gòu)建骨質(zhì)疏松并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠梁小骨明顯減少并排列紊亂，脂滴增多，主動(dòng)脈血管也出現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病理改變，提示模型構(gòu)建成功。而經(jīng)丹參注射液治療后，股骨組織和主動(dòng)脈組織病變均有所減輕。

骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物又稱骨代謝標(biāo)志物，其變化反映體內(nèi)骨代謝平衡的變化，因此常被用于評(píng)價(jià)骨折危險(xiǎn)性以及治療骨質(zhì)疏松藥物的療效[16]。BLAP和OC都是骨形成的重要標(biāo)志物，其中BALP由成骨細(xì)胞合成分泌，在臨床上常用于評(píng)價(jià)體內(nèi)成骨細(xì)胞的活性；OC由成熟的骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成分泌，隨著骨組織礦化及成骨細(xì)胞分化增加，OC也特異性增加[17-18]。血液中的TRAP來源于破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血小板等，分為兩種同工酶a和b，其中TRAP5b是骨吸收的主要標(biāo)志物，能反映體內(nèi)破骨細(xì)胞的活性[19]。在本研究中，模型組小鼠血清BALP、OC、TRAP5水平相較于對(duì)照組顯著升高，骨轉(zhuǎn)換率提高，經(jīng)丹參注射液治療后BALP、OC、TRAP5水平均明顯降低且呈劑量依賴性，提示丹參注射液能有效抑制骨形成和骨吸收，使骨代謝趨于平衡狀態(tài)。

血液中的TC、TG和血管壁脂質(zhì)容易被自由基氧化導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物沉積，引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化[20]。LDL-C參與膽固醇向肝外轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，其水平過高會(huì)促進(jìn)TC、TG沉積[21]，而HDL-C參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，有利于減輕脂質(zhì)負(fù)荷[22]。此外，在氧化應(yīng)激作用下，LDL易被氧化成為ox-LDL，進(jìn)一步激活平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的表面受體，引發(fā)一系列急性炎癥反應(yīng)，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵啟動(dòng)因素[23-25]。本研究中模型組小鼠TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平升高，HDL-C水平降低，提示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，而丹參注射液可以明顯逆轉(zhuǎn)以上指標(biāo)，降低血脂水平。這與張紅珍等[26]探索補(bǔ)陽還五湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠的影響結(jié)果一致。以上結(jié)果表明丹參注射液不僅能夠降低骨質(zhì)疏松小鼠的骨轉(zhuǎn)換率，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化也有一定的治療效果。

綜上所述，丹參注射液可以通過促進(jìn)骨代謝平衡和降低血脂水平，對(duì)小鼠骨質(zhì)疏松合并動(dòng)脈粥樣硬化起到緩解作用。