基于網絡藥理學探討青娥丸治療絕經后骨質疏松癥的作用機制

邸學士 陳昭 賈育松 李晉玉 鄭晨穎 白春曉 張帆 劉楚吟 袁巧妹 龍水文 冉宇 康晟乾 陳江*

1.北京中醫藥大學，北京 100029 2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)是一類常見的代謝性骨骼疾病，威脅著絕經后女性的生命健康[1]。PMO機制復雜，與女性生理退變相關，絕經后女性由于雌激素分泌減少，體內出現氧化應激反應，活性氧的大量存在不僅抑制骨形成，而且促進了骨的吸收，最終引起骨質流失[2]。目前，西醫治療PMO的藥物主要包括鈣劑、維生素D、抗骨吸收藥物及骨活性藥物[3]等，但往往存在價格昂貴、不良反應等問題。而中醫論治從整體出發，治病求本，中藥在抗骨質疏松治療中逐漸發揮更多的作用。

PMO屬于中醫學 “骨痿”、“骨痹”、“骨枯”的范疇，絕經期婦女腎氣開始衰敗，并進展為腎精虧虛，形成骨痿，治療以補腎健骨為主[4]。青娥丸首見于《太平惠民和劑局方》，為補腎壯骨的經典方劑。由補骨脂、杜仲、核桃仁、大蒜四味中藥構成。其中補骨脂“能暖水臟，陰中生陽氣”，為補腎壯陽之品；杜仲歸肝腎經，具有“堅筋骨”之效；核桃仁，味甘性溫，補腎溫肺，三藥和之與大蒜共達補腎強骨之功。已有基礎研究證實青娥丸具有維持PMO患者骨密度、抑制骨吸收[5]、促進骨形成[6]的作用，能夠改善機體骨代謝平衡。

現為了進一步探討青娥丸治療PMO的可能作用機制，本研究采用網絡藥理學方法，挖掘青娥丸治療PMO的潛在有效成分、靶標、并對關鍵靶標進行基因本體功能及信號通路分析，為今后的抗PMO治療及深入研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 青娥丸中藥化合物的獲取及活性成分篩選

以“杜仲”、“補骨脂”、“核桃仁”、“大蒜”四味中藥為檢索詞匯，分別在中藥系統藥理學分析平臺[7](TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中醫藥百科全書數據庫[8](ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php)、SymMap數據庫(https://www.symmap.org/)進行檢索，匯總獲取各中藥化合物成分，并在TCMSP平臺依據生物利用度(OB)≥30 %，與已知藥物相似性(DL)≥0.18，篩選出中藥活性成分，并通過文獻檢索對活性成分進行補充。

1.2 青娥丸中藥活性成分靶標預測

通過上述數據庫及文獻檢索獲取各中藥活性成分CAS編號，登錄有機小分子生物活性數據庫(pubchem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)對CAS編號搜索，獲取活性成分的2D結構文件，借助 SwissTargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)對活性成分的結構進行配體相似度交叉驗證和分析排列，實現中藥活性成分靶標預測[9]。對預測結果，進行“Probability值>0”的篩選，結果即為青娥丸中藥活性成分的作用靶標。

1.3 青娥丸治療PMO潛在靶點獲取

將“Postmenopausal Osteoporosis”作為檢索詞匯，分別在GeneCards、OMIM、DisGeNET[10]三個疾病靶點數據庫進行PMO相關靶點檢索，匯總三個數據庫靶點結果，去除重復基因，即為疾病相關靶點。通過ImageGP平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將上述中藥活性成分靶點與PMO相關靶點映射，繪制韋恩圖，交集即為青娥丸治療PMO潛在作用靶點。

1.4 中藥-活性成分-靶點網絡構建

上述中藥、活性成分、交集靶點分列整理，通過Cytoscape 3.7.1軟件，構建中藥-活性成分-交集靶點網絡圖，應用“Network analyzer”插件對網絡圖的節點度值進行分析，其值越大，表示該節點在網絡中越重要。

1.5 PPI網絡構建

將青娥丸治療PMO潛在作用靶點基因輸入STRING數據庫(https://string-db.org/)，Organism設置為“Homo sapiens”，勾選高信度(high confidence0.7)，并隱藏網絡中斷開連接的節點，獲取青娥丸治療PMO潛在作用靶點的蛋白質互相作用關系(protein-protein interaction，PPI)，通過Cytoscape內置的網絡分析插件，對其進行拓撲分析，并繪制蛋白相互作用關系網絡圖。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路分析

通過上述PPI網絡拓撲分析獲得青娥丸治療PMO關鍵靶點，并導入DAVID 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，分別進行基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析及KEGG通路富集分析，其中GO分析包含：生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cellular component,CC)三個內容，篩選排名靠前的基因功能及通路，應用http://www.bioinformatics.com.cn/平臺繪圖。

2 結果

2.1 青娥丸活性成分篩選結果

經過TCMSP數據庫、ETCM數據庫、SymMap數據庫搜索，同時滿足OB≥30 %、DL≥0.18篩選，獲得活性成分37種，文獻補充已被證實的3種活性成分補骨脂素[11]、紫云英苷[12-13]、異補骨脂素[14-15]，共計40種活性成分，其中olivil、3-Hydroxymethylenetanshinquinone、ent-Epicatechin、Helenali、liriodendrin_qt及(E)-3-[4-[(1R,2R)-2-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-1-methylol-ethoxy]-3-methoxy-phenyl]acrolein 此6種活性成分因無對應靶標被剔除，將剩余34種活性成分納入本研究，詳見表1。

表1 活性成分Table 1 The active components

續表1 活性成分Continued table 1 The active components

2.2 靶點預測

通過SwissTargetPrediction平臺，對篩選出的40種青娥丸活性成分進行靶點預測，其中6種成分無對應靶標，對剩余34種活性成分靶標預測結果進行Probability值>0的篩選，去掉重復值，共獲取532個青娥丸作用靶點。通過GeneCards數據庫、OMIM數據庫、DisGeNET數據庫獲取1 166個PMO相關靶點基因，通過ImageGP平臺，對兩組基因取交集，獲得178個青娥丸治療PMO的潛在作用靶點，見圖1。

圖1 “青娥丸靶標基因-PMO相關基因”韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Qinge pill target gene - PMO-related genes

2.3 中藥-活性成分-交集靶點網絡構建及分析

構建“中藥-活性成分-交集靶點”網絡圖，詳見圖2。該網絡由216個節點、688條邊組成，其中飛燕草素、槲皮素、桑色素、丁香亭、山奈酚、異補骨脂黃酮度值排名前6位，度值分別為47、46、46、46、45、34，在青娥丸治療PMO過程中可能發揮著重要作用。

注：其中青色圓形節點代表青娥丸中藥，紫色六邊形節點代表補骨脂活性成分，黃色六邊形節點代表杜仲活性成分，粉色六邊形節點代表核桃仁活性成分，墨綠色六邊形節點代表大蒜活性成分，藍色棱形節點代表青娥丸治療PMO潛在作用靶點。圖2 “中藥-活性成分-靶點”網絡圖Fig.2 Network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredients-intersection targets

2.4 PPI網絡分析及關鍵靶點獲取

經STRING數據庫獲取獲青娥丸治療PMO潛在作用靶點的互相作用關系，通過Cytoscape 3.7.1繪制靶點蛋白互相作用關系網絡圖，如圖3所示，圖中節點表示靶點蛋白，邊表示兩個蛋白相連，網絡中共計172個靶點蛋白，927條邊。度值越高，節點越大，在網絡中所占有的地位越大，節點度值平均值為10.5，并以度值大于10.5為條件共篩選出68個靶點蛋白，作為青娥丸治療PMO的關鍵靶點。其中度值排名前10位分別為：MAPK1、AKT1、PIK3CA、PIK3R1、APP、SRC、MAPK8、HSP90AA1、EGFR、JAK2，度值分別為：47、46、44、43、37、37、35、33、32、30，推測其在青娥丸治療PMO過程中具有重要地位。

注：依據節點度值屬性對節點大小及顏色進行調節，依據節點間相互作用強度對邊的粗細和顏色進行調節。圖3 青娥丸治療PMO的靶點基因蛋白互作網絡Fig.3 The target gene protein-protein interaction network of Qinge pill for PMO

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析

對篩選得到的關鍵靶點進行GO和KEGG分析。應用bioinformatics平臺繪圖。圖4所示為GO分析結果：其中，BP相關條目278條，生物過程主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調控、可卡因反應、信號轉導、蛋白質磷酸化等生物過程。MF相關條目75條，分子功能包括：與酶結合、激酶活性、胰島素受體底物結合、與蛋白質結合、蛋白質酪氨酸激酶活性等；CC相關條目46條，細胞組成涉及質膜、膜筏、細胞核等部位。

圖4 青娥丸關鍵靶點GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of the key targets of Qinge pill

圖5為KEGG通路富集分析結果，篩選了青娥丸治療PMO關鍵靶點前20個相關通路，主要包括：癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路、HIF-1信號通路，以及雌激素、催乳素、甲狀腺激素三個激素類信號通路等。

圖5 青娥丸關鍵靶點KEGG 通路富集Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Qinge pill

3 討論

青娥丸作為PMO中醫藥診療指南推薦用方[16]，其組成中補骨脂不僅具有類雌激素作用[17]，還可通過介導信號通路調節骨代謝進而緩解PMO[18]。杜仲已被證實可以調節去卵巢大鼠的雌激素水平，促進骨代謝平衡[19]。核桃仁則能夠改善體內脂質過氧化，清除體內過多的氧自由基[20]，由于活性氧的大量存在會引起骨質流失，所以筆者推測核桃仁的抗氧化作用為其治療PMO提供潛在可能。

本研究篩選出飛燕草素、槲皮素、山奈酚、異補骨脂黃酮等重要化合物，其中，飛燕草素已被證實可通過上調BMP-2、Runx-2兩個骨細胞特異基因來促進骨的形成[21]，同時可抑制破骨細胞分化來防止骨吸收[22]。此外，飛燕草素對氧化應激反應具有防護作用[23-24]，其也可能通過抑制氧化應激反應，發揮抗PMO作用。王雪峰等[25]發現山奈酚可調節鈣離子代謝，促進骨的生成；國外學者[26]通過細胞試驗發現山奈酚能夠抑制細胞自噬活動，限制破骨細胞生成。同樣，槲皮素不僅可以抑制骨吸收[27]，還能夠通過刺激骨形成作用蛋白BMP2及上調Smad4的表達水平來促進成骨分化，改善PMO病情[28]。槲皮素和山奈酚均具有成骨和破骨雙向調節的作用，二者在改善骨代謝平衡及在治療PMO方面具有廣泛應用前景。

通過PPI靶點網絡分析得到青娥丸治療PMO的重要靶點：MAPK1、AKT1、PIK3CA、PIK3R1、MAPK8、JAK2等。其中MAPK1、MAKE8均屬MAPK信號通路成員，該通路可通過線粒體途徑干預成骨細胞凋亡[29]，MAPK1(絲裂原活化蛋白激酶1)又名ERK2(細胞外調節蛋白激酶2)，可通過ERK1/2通路介導成骨細胞分化[30-31]。AKT1是AKT(蛋白激酶B)的基因族成員，研究發現對大鼠進行去AKT1基因敲除處理后，大鼠出現骨骼發育受限，提示AKTI在骨骼發育中可能發揮促進骨生長作用[32]，同時AKT1與PIK3CA、PIK3R1共同作為PI3K-Akt信號通路成員，通過該通路在骨代謝過程中發揮調節作用[33-34]。JAK2作為JAK/STAT信號通路成員，李常虹等[35]認為JAK/STAT信號通路可通過參與炎癥反應引起骨破壞的發生。通過GO富集分析可推測，這些關鍵靶點主要在質膜、膜筏、細胞核等位置發揮作用，并通過一氧化氮生物合成過程的正調控、信號轉導、蛋白質磷酸化等生物過程，發揮激酶活性、與蛋白質結合、與蛋白激酶結合等分子功能。

KEGG富集分析排名靠前的通路中，PI3K-Akt信號通路是骨代謝過程中的重要信號通路，具有介導成骨細胞增殖[36-37]、成骨細胞分化[38]、干預破骨細胞凋亡[39]作用，值得一提的是，本研究篩選出的關鍵靶點AKT1、PIK3CA、PIK3R1均屬于該通路成員，研究結果相互驗證。HIF-1信號通路此前已被證實能夠促進骨形成[40]，但國內學者在動物實驗中發現抑制HIF-1信號通路，實驗小鼠的骨質疏松程度得到改善，骨代謝破骨指標降低的同時，骨代謝成骨指標也降低[41]，筆者推測該通路可能以參與破骨細胞活性調節為主發揮抗PMO作用。本研究還涉及三個激素類信號通路：雌激素信號通路通過雌激素受體上調OPG/RANKL表達來促進成骨細胞增殖分化[42]，同時上調CFTR誘導破骨細胞的凋亡，具有成骨和破骨雙向調節作用。泌乳素信號通路通過作用于生殖軸，抑制甾體激素的合成，介導骨代謝[43]；甲狀腺素則是通過直接或間接作用于軟骨細胞、破骨細胞、成骨細胞實現對骨轉化的作用[44]，但其具體病理機制，尚未達成學術共識。癌癥信號通路盡管在本研究通路富集分析中位列首位，但因該通路與PMO相關研究報道甚少，其能否介導PMO及介導機制有待后續研究探討。

綜上所述，青娥丸治療PMO是通過青娥丸中多種活性成分作用于多個基因靶點，各靶點基因功能復雜多樣，通過不同信號通路調節骨代謝，體現了青娥丸治療PMO具有多成分、多靶點、多途徑的特點，并為今后青娥丸治療PMO作用機制的深入研究提供參考。