益生菌/益生元調節骨代謝機制的研究進展

程引 張治國

中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700

在整個生命周期中，骨骼為保持其結構和功能的完整性，需要不斷地進行重建活動。在成年人的骨骼中，每年更換原有骨骼的5 %到10 %[1]。骨重建活動主要由主導骨吸收的破骨細胞(osteoclasts，OC)和主導骨形成的成骨細胞(osteoblasts，OB)介導，并受多種細胞因子、激素、生長因子和轉錄因子的調節[2-3]。各種因素直接或間接影響骨重建，導致骨吸收/骨形成失衡，是骨代謝相關疾病的典型特征。其中骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種代謝性骨骼疾病，以骨量降低、骨微觀結構破壞、骨脆性增加，易發生骨折為特征，是骨吸收/骨形成失衡典型例子[4]。有研究[5]表明，年齡50歲及以上的人群，約有三分之一的女性和五分之一的男性會因骨質疏松癥而發生骨折，尤其是髖部骨折具有高致殘率和致死率[6]。隨著人類微生物組學研究的不斷深入，腸道微生物對于健康和疾病的影響成為熱點，而腸道微生物與骨代謝的關系也受到越來越多研究者的關注[7-9]。

“微生物組”(microbiome)一詞由諾貝爾獎獲得者Josh Lederberg最先提出，是指微生物、微生物基因組以及它們在特定環境中的相互作用的集合[10]。腸道微生物(gut microbiota，GM)是人體中數量最多、種類最豐富和作用機制最復雜的微生物群，也是目前與機體疾病關聯研究最多的微生物群。研究顯示，GM與炎癥性腸病[11]、結直腸癌[12]、肥胖[13]、糖尿病[14]、骨質疏松癥[7-9]等相關，甚至可能成為抗菌素耐藥基因的儲存庫[15]。Ohlsson等[16]提出“骨微生物學”(osteomicrobiology)概念，以強調二者密切的相互關系，認為GM可能通過改變全身及骨髓的免疫狀態調節OC生成進而影響骨代謝，并指出GM可能成為治療OP和預防骨折的一個新的治療靶點。

既往關于GM影響骨代謝的動物實驗主要基于三種模式，給予益生菌和/或益生元干預，使用廣譜抗生素治療，以及在無菌條件下培養[17]。益生菌被定義為在給予足夠量時對健康有益的活性微生物[18]，而益生元是促進有益微生物生長和/或促進微生物代謝物質有益變化的不可消化的可發酵食品成分[19]。國內外多項研究論述了益生菌/益生元補充劑可通過改變腸道菌群狀態影響骨代謝，且在多種益生菌菌株和不同疾病的實驗動物模型中得到證實[20-22]。本文結合相關文獻試從調節免疫功能、腸上皮屏障功能、短鏈脂肪酸代謝產物等幾個方面闡述益生菌/益生元影響骨代謝的機制。

1 調節免疫功能

前人的研究證實，GM可在生理或疾病狀態下通過CD4+T細胞等炎癥細胞因子的表達來調節骨生成或骨量丟失，從而影響小鼠的骨量[23-24]。由于GM數量龐大、種類龐雜，對于其具體作用機制的闡述尚不充分，然而越來越多的研究證明益生菌/益生元可能是GM調節骨量的主要機制之一[25]。

Ohlsson等[26]從小鼠去卵巢前2周開始，給其飲用副乳桿菌DSM13434和副乳桿菌DSM13434、植物乳桿菌DSM-15312、DSM-15313的混合制劑，6周后發現這些益生菌均改變了小鼠的免疫狀態，抑制了去卵巢(ovariectomized，OVX)誘導的骨吸收。Britton等[27]以12周齡的OVX小鼠為研究對象，發現羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)治療能夠抑制CD4+T淋巴細胞的增加和腫瘤壞死因子信號的分泌從而抑制OC的產生，阻止了OVX誘導的RANKL水平的增加，也降低了破骨細胞標志物TRAP5 mRNA水平。Collins等[28]使用Rag1基因敲除(缺乏成熟T和B淋巴細胞)小鼠進行實驗，同樣發現淋巴細胞在介導L.reuteri6475抑制骨量丟失中起著關鍵作用；用腸系膜淋巴結和CD3+T細胞進行的體外研究發現，L.reuteri6475以濃度依賴的方式增加IL-10和干擾素γ的表達；其分泌的因子還可增強MC3T3-E1成骨細胞中的轉錄因子Osterix的表達。T細胞各亞型都能夠影響骨細胞，尤其是調節性T細胞(regulatory cells，Treg)和輔助性T細胞17(Th17細胞)，Treg細胞抑制OC生成，Th17細胞誘導OC生成，二者的動態平衡在人體內各種炎癥條件下十分重要[29]。研究發現嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus，LA)可升高OVX小鼠體內Treg細胞數量，降低Th17細胞數量，通過調節Treg-Th17細胞平衡增加骨量；此外，LA還可抑制促進骨吸收的細胞因子(IL-6、IL-17、RANKL、TNF-α)表達，并誘導抑制骨吸收的的細胞因子(IL-10和IFN-γ)表達，進而防止OVX導致的骨量丟失[30]。這些研究表明益生菌/益生元通過影響免疫功能或抑制骨吸收、或促進骨形成、或二者兼之，最終起到調節骨代謝，延緩OP發生發展的作用。

2 調節腸道上皮屏障功能

腸上皮屏障功能受損是GM介導繼發性骨質疏松癥及絕經后骨質疏松癥發生的一個重要環節。腸上皮是宿主和腸道微生物之間的屏障，腸道通過細胞旁間隙控制腸腔和上皮黏膜下層之間的分子運輸。在生理條件下，細胞旁間隙阻止半徑大于1.5 nm的分子通過[31]。病理情況下，如OVX小鼠性激素缺乏可導致腸道縫隙連接蛋白(如Claudin 2、3和以及JAM3)等分子的轉錄水平降低，腸道通透性增加從而造成骨量丟失[32]。而相關研究發現益生菌/益生元在維持腸道屏障功能，預防骨質疏松癥方面有著令人驚喜的效果。

Li等[21]的研究發現無菌(germ free，GF)小鼠性激素缺乏不會導致骨量丟失，說明了GM在介導骨量丟失中的重要作用。而常規喂養的去勢小鼠被分別飼喂鼠乳糖李桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)和VSL#3TM后，可導致腸道通透性降低，延緩去卵巢引起的骨量丟失。另一項研究發現，普通小鼠經抗生素干預導致腸道微生態失衡，腸道通透性顯著增加，引發骨小梁破壞和骨量丟失；經飼喂L.reuteri可降低抗生素治療后厚壁菌/擬桿菌的比例，防止腸上皮屏障破壞，并減少股骨和椎骨小梁的骨量丟失[33]。益生菌/益生元除降低腸道通透性、改變腸道菌群比例外，還可通過其他通路調節腸上皮屏障功能，預防OP發生。如提高腸上皮細胞緊密連接相關分子水平[34]；調控腸上皮黏膜表觀遺傳及礦物質吸收信號通路[35]。

3 調節短鏈脂肪酸代謝

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)是由食物中不可消化的碳水化合物(主要是膳食纖維)經腸道細菌發酵而產生。現有研究表明，SCFAs通過多種作用機制影響骨代謝過程，如直接抑制OC分化[36]，通過Treg細胞促進OB分化[37]以及降低腸道pH值促進鈣的吸收[38]等。腸道中SCFAs的類型和含量不僅取決于所攝取食物纖維的類型和腸道消化食物的持續時間，還取決于腸道微生物群的組成和活性，如乙酸由許多類型的細菌產生的，而丙酸和丁酸只由有限的幾種細菌產生[39-40]。益生元/益生菌主要通過改變腸道微生物的菌群結構來調節SCFAs的含量和類型，從而影響骨代謝。

Tyagi等[41]給予常規飼養的10周齡雌性小鼠口服LGG 4周，發現補充LGG不僅改變腸腔內微生物多樣性，還可增加梭狀芽孢桿菌的比例，使小腸組織和血清中丁酸水平升高，骨形成標志物也隨之增加。另一項研究表明，低聚果糖(fructo-oligosaccharide，FOS)和低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)等益生元增加動物骨密度的機制主要是調節腸道中雙歧桿菌的比例，從而提高SCFAs的含量以及有效成分的利用度[42]。Rodrigues等[43]的研究結果佐證了這一觀點，FOS或長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum，B.longum)喂養大鼠4周后，大鼠盲腸總厭氧菌數、盲腸重量、盲腸內及外周血丙酸濃度以及骨質量、骨強度均高于對照組。雖然補充不同種類的益生菌/益生元發酵后產生不同類型、不同濃度的SCFAs[44]，但其最終都可正向調節骨代謝，促進骨吸收/骨形成平衡，有效防治OP。

4 其他機制

既往諸多研究已證實，益生菌/益生元在礦物質代謝中起到重要作用。無論在生理或病理狀態下，益生菌/益生元均可增強嚙齒動物和人類的鈣吸收[45]；菊粉提高骨礦質含量的作用在動物實驗和臨床研究中均得到了證實[46]；經FOS干預的胃切除大鼠鈣吸收增加[47]；菊糖和果寡糖都可增加OVX大鼠的鈣吸收[48]；雪蓮果粉和長雙歧桿菌喂養的大鼠脛骨鈣、磷、鎂含量顯著高于對照組，從而起到預防OP的作用[43]。另外，研究發現長雙歧桿菌可以通過上調SPARC和BMP-2基因的表達來促進成骨過程，增加骨密度[49]。

益生菌/益生元調節骨代謝機制見表1。

表1 益生菌/益生元調節骨代謝機制Table 1 The regulatory mechanism of probiotics and prebiotics in bone metabolism

5 展望

骨微生物學是指有關微生物和微生物群在健康和疾病中的作用以及微生物群調節出生后骨發育、骨老化和病理性骨量丟失的機制的調查[16]。腸道微生物作為人體最大的微生物群體，在既往研究中大多采用兩類方法研究其對骨代謝的作用，①調節微生物數量(通過抗生素干預或使用無菌小鼠)；②調節微生物種類(通過添加益生元或益生菌)。由于腸道微生物群的個體間差異較大，益生菌的來源、數量、種類、功能也難以一致，且以往大多數研究都基于動物模型，若要設計進行規范、標準、成規模的臨床研究具有一定難度。

本文從調節免疫功能、調節腸上皮屏障功能、調劑短鏈脂肪酸代謝等方面綜述了益生菌/益生元影響骨代謝的機制。不難發現這些機制之間有一定關聯，同一種益生菌可能發揮不同的功能，同一機制也可由不同的益生菌介導。在未來，除進一步發現篩選菌株和探索相關機制，多菌株的聯合使用以實現調節骨代謝功能的優化應是一個研究方向。