犬瘟熱診斷技術的研究進展

程敏姮，張啟龍，潘珺，李蕊，高敏，苗燕，鄭博君，張瑋，傅彩霞

(北京市動物疫病預防控制中心,北京 102629)

犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)屬副黏病毒科，并與麻疹病毒和牛瘟病毒同屬麻疹病毒屬，親緣關系較近[1]。CDV為不分節、非重疊、有囊膜的單股負鏈RNA病毒[2]，基因組約包含約15 690個核苷酸并主要編碼核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白基質(L)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)[3-4]。該病毒是一種泛嗜性病毒，可侵害呼吸系統、血液系統、消化系統、免疫系統，甚至是神經系統，從而引起機體全身性病理變化，造成大批發病死亡，死亡率在30%～80%之間。CDV宿主廣泛，包括犬科等所有食肉目科以及偶蹄目豬科、鰭足目海豹科、貓科，近幾年大熊貓、老虎、靈長目獼猴科都相繼出現犬瘟熱病例[5-7]。隨著環境的變化，CDV對動物的適應性逐漸增強，免疫動物的發病率和死亡率也在升高，即使在美國、日本等大范圍定期接種疫苗的地區也可能暴發[8]。迄今為止，對于該病的防治措施除定期接種疫苗外，尚無特異有效的治療方法。因此，確定一種敏感性高、特異性好、快速簡便且適用于基層快檢或實驗室高通量檢測的診斷方法尤為重要。

1 臨床診斷

犬瘟熱主要有兩種臨床表現，分別為急性型和慢性型[4]。其中急性型病例呈現雙相熱，出現皮疹、呼吸困難、咳嗽、打噴嚏、厭食、結膜炎及黏液或膿性眼鼻分泌物等臨床癥狀。隨著病程發展，常伴隨有細菌或支原體二次感染，繼而出現腹瀉、血便、嘔吐等癥狀，部分甚至出現神經癥狀，表現為抽搐、眼球震顫、共濟失調、姿勢反應障礙、癱瘓或麻痹，在病程晚期通常出現脫髓鞘性腦炎。慢性型的感染動物發病遲緩，免疫應答反應不強烈，同時伴有一些不明顯的早期臨床癥狀。有些毒株感染細胞能力低，不易形成包涵體，例如A75/17毒株可以入侵大腦某些區域而未引起炎癥反應，且能夠在中樞神經系統內長期存在。

臨床診斷需要豐富的臨床經驗才能做出初步診斷，且僅靠臨床癥狀并不能作為犬瘟熱確診的依據，還需配合其他方法進行確診。

2 傳統診斷技術

2.1 組織病理學檢測

CDV經呼吸道上皮細胞感染機體后入侵淋巴組織、扁桃腺和支氣管淋巴，繼而造成肺、腎、脾臟、心臟、肝臟、胃腸黏膜等組織器官出現出血、腫大等現象。置于光學顯微鏡下觀察，可見心、腎、肺淋巴細胞浸潤，肺泡腔內有大量紅細胞和壞死的肺泡上皮細胞，腎上皮細胞發生核固縮[9]。同時感染細胞中可見紅色或暗紅色、勻質、邊界清晰的包涵體，一般為圓形或橢圓形，也有呈鐮刀形而緊貼于胞核上的，存在于核內的包涵體。包涵體是CDV感染的重要標志之一[10]。置于電鏡觀察下，可見犬瘟病毒粒子呈現多形性，多數為球形，病毒粒子的直徑為110～550 nm之間。核衣殼呈螺旋狀，總長度為1 000 nm，螺旋直徑15～19 nm，螺旋中心5 nm的孔，螺距5～6 nm。病毒有囊膜，其內部為M蛋白，后約5 nm，表面為H和F兩個糖蛋白組成的纖突，長度為9 nm[11]。房紅瑩等[12]將免疫電鏡技術與離子捕獲電鏡技術相結合，建立了改良版離子捕獲電鏡法，提高了完整CDV粒子的檢測率，其效果要比單純的離子捕獲電鏡法強。

組織病理學檢測可以根據組織病變、病毒結構、典型包涵體等特征，更直觀的鑒別病毒，但是該方法制備過程較為復雜繁瑣，非專業人士無法操作，故一般不作為常規檢查手段，僅限于研究應用。

2.2 病毒的分離培養

分離培養是研究病原體最直接的方式，目前常用于CDV病毒分離的細胞主要有兩類，即原代細胞和傳代細胞系。宋爽[13]驗證了9種細胞對犬瘟熱病毒的敏感性和操作性，試驗表明對弱毒CDV敏感的細胞系(Vero等傳代細胞系)對臨床流行株不敏感，不能形成CPE，也不感染。John等[14]研究表明在細胞傳代與接毒時添加胰酶，細胞可出現CPE。肺泡巨噬細胞(DLM)對臨床流行株敏感且分毒效率較高，但是試驗要求高，不適宜推廣使用。而外周血淋巴細胞(PBL)容易獲得，對臨床流行株敏感度又高，操作也簡單易行，適宜作為臨床流行株分離的細胞。對現有細胞系的改造也大大提高CDV分離率，趙建軍等[15]通過建立穩定表達CDV細胞受體SLAM的Vero細胞系實現了CDV快速分離。

CDV對外界環境的抵抗力較弱，其脂質囊膜結構較脆，易被光和熱滅活，因此病毒分離成功率較低。此外CDV分離培養的工作量大，不適宜作為臨床快速診斷的診斷方法。

2.3 免疫學檢測

免疫學檢測是臨床上較為常用的方法，包括病毒中和試驗、瓊脂擴散試驗、ELISA、免疫熒光等。病毒中和試驗具有較高的特異性，既用于病毒株的種型鑒定，還用于血清中和抗體效價的測定，是國內外診斷CDV和臨床上監測免疫效果的標準方法，但該方法操作繁瑣、耗時長、工作量大。Woemle等人于1966年就將瓊脂擴散試驗進行標準化，1994年我國研究者任文陟等[16]建立了犬瘟熱瓊脂擴散試驗方法，并與電鏡結果相比較，其陽性符合率達85.7%，總體符合率為90%，該方法操作簡便，但敏感性差。

ELISA在犬瘟熱病毒感染的早期和持續感染中因快速、敏感、易于標準化等優點已廣泛用于CDV的檢測[17-19]。蔡孜萌等[20]以純化的重組H蛋白作為包被抗原建立了CDV間接ELISA檢測方法，該方法具有良好的敏感性、特異性和重復性，與商品化檢測試劑盒的符合率達92.5%。Chan等[21]應用原核表達系統制備CDV 的H蛋白，將其作為檢測抗原，用于檢測犬血清中抗體，具有良好的穩定性和特異性。Labrini等[22]研究表明直接免疫熒光法具有高特異性和高敏感性，且與PCR檢測結果有較好的一致性，而結膜細胞學檢測效果差。但ELISA方法存在重復性差、易出現假陽性等不足，且干擾因素較多，如自身抗體、儀器、操作、溫度等。

2.4 PCR檢測

Shin等[23]對建立的RT-PCR和套式PCR進行了對比，結果表明套式PCR的敏感性高于普通的一步法RT-PCR。為了同時檢測CDV和犬冠狀病毒，Wang等[24]建立了一種快速簡便、高特異性和敏感性的雙重RT-PCR檢測方法。采用優化的雙重RT-PCR方法對北京、山西和安徽等地區進行檢測，其檢出率分別為12.35%、7.5%、13.63%。張洪亮等[25]根據H基因建立了可鑒別診斷疫苗株和野毒株的RT-PCR-RFLP方法，為臨床上CDV的疫苗株和野毒株的鑒別診斷提供了依據。

與上述幾種檢測方法相比，普通RT-PCR具有更高的敏感性和特異性，但相比熒光定量PCR而言，普通PCR存在產物易污染、假陽性、不能定量檢測等缺點。

2.5 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR以其敏感、快速等特點越來越多的應用在疫病診斷領域。Elia等[26]建立的CDV TaqMan實時熒光定量PCR具有較高的特異性和敏感性，能夠檢測100 copies。由叢華等[27]根據CDV的M基因建立了SYBR Green熒光定量PCR，該方法特異性高、重復性良好，最低檢出限為10 copies，并能有效鑒別犬瘟熱的強弱毒株。趙雪麗等[28]根據CDV的H基因和CPV的VP2基因建立了犬瘟熱和犬細小病毒雙重實時熒光定量PCR，該方法靈敏、特異、高通量和可準確定量等優點，其最低檢出限為10 copies，兩種病毒同時或單獨存在，或濃度相差較大時均不影響對核酸的定量檢測。王介淞等[29]根據CDV的核衣殼蛋白(NP)基因建立了TaqMan實時熒光定量PCR，該方法可以成功檢出水貂外周血淋巴細胞中的CDV。近年來吉林、山東、上海等地相繼頒布實施了以熒光定量PCR為診斷方法的地方標準[30-33]。

與普通PCR相比，實時熒光定量PCR具有高靈敏度、高特異性、高自動化、安全無污染等優點，可以通過計算機和分析軟件實現PCR擴增、產物檢測和定量分析一體化，同時杜絕了傳統PCR開放檢測對環境的污染和由此導致的假陽性。但是熒光定量PCR需要特殊的實驗儀器，對于臨床及基層的普適性較差。

3 快速診斷技術

3.1 試紙條診斷技術

犬瘟熱膠體金試紙條是采用膠體金免疫層析技術研制而成，一般采用雙抗體夾心方式，屬于一步式固相膜反應。該方法具有快速、簡便、廉價、可單份檢測、穩定性好、特異性高、檢測標本種類多等優點。目前也是寵物醫院等臨床用于CDV檢測中使用最廣泛的檢測方法。但是該方法的靈敏度和特異性與RT-PCR相比較低，且不能定量檢測34]，敏感性較低。陳崢嶸[35]根據179株Asia-Ⅰ型CDV的H基因和3株弱毒疫苗株H基因設計出AS-PCR上游特異性引物和下游通用引物，同時制作相應的AS-PCR核酸試紙條，該方法可以區分野毒株和疫苗株。但該方法可能存在地域限制的不足，其核酸試紙條也沒達到最優預期效果。

3.2 重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification,RPA)

RPA是一種新型的等溫基因擴增技術，該技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由2個相對的引物起始一個合成事件。該反應在37 ℃左右，一般可在10～20 min獲得可檢出水平的擴增產物，反應靈敏、設備要求低，適合臨床快速檢測[36]。已在病毒、細菌、寄生蟲等病原檢測方面得到較好的應用[37-40]。Wang等[41]建立一套快速、簡便、可靠的RT-RPA檢測方法，該方法只需在40 ℃下進行，反應3～12 min即可觀察到結果，既可用于實驗室診斷也可用于寵物醫院臨床檢測，尤其在條件有限的情況下也可完成檢測。熊煒等[42]建立了一套實時熒光RPA檢測方法，該方法在39 ℃恒溫反應25 min即可判讀結果，且具有良好的穩定性、可靠性、特異性和敏感性。

3.3 環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是一種新型基因擴增方法，其特征是針對靶基因上的6個區域設計4條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進行擴增反應，可在15～60 min內實現109～1 010倍擴增，反應能產生大量的擴增產物即焦磷酸鎂白色沉淀，可以通過肉眼觀察白色沉淀的有無來判斷靶基因是否存在。Cho等[43]根據CDV的N基因建立了RT-LAMP檢測方法，該方法在65 ℃恒溫下反應60 min即可完成，且可直接目視檢測結果。與熒光定量PCR相比，檢測時間短、操作簡便、可目視觀察結果。胡嘉欣等[44]建立的CDV RT-LAMP檢測方法可檢測到RNA的濃度為5.6×10-6ng/μL，試驗過程比國標RT-PCR縮短了1.5 h。何麗麗等[45]根據CDV的N基因建立的RT-LAMP方法可檢測到70 copies。郝鐲等[46]建立了一種新型、穩定、可普遍應用的犬瘟熱RT-LAMP-LFD檢測方法，該方法是將環介導等溫擴增技術與橫向流動試紙條相結合，具有特異性強、敏感性高、操作簡便等優點，最低檢測限為100 copies。目前環介導等溫擴增技術已在食品檢測、結核病等領域有著廣泛應用[47]，但在動物疫病領域應用的報道還較少，LAMP方法的優勢除了高特異性和高靈敏度外，操作還十分的簡單，在應用階段對儀器的要求低，一個簡單的恒溫裝置就能實現反應，結果檢測也非常簡單，直接肉眼觀察白色沉淀或者綠色熒光即可，具有高效、快速、便捷的特點，更加適于在臨床和野外監測站進行推廣使用。但目前應用于犬瘟熱的檢測方法的最終結果判定依然是依靠濁度儀、熒光檢測儀來觀察判定，或是通過濁度目視判定。

3.4 基因芯片技術

基因芯片技術是通過把巨量的已知的寡核苷酸、肽核苷酸或cDNA固定在一塊面積很小的硅片、玻片或尼龍膜上而構成DNA/RNA微陣列，然后將樣品基因組DNA/RNA進行體外擴增并滲入標記分子后，與位于微陣列上的已知DNA序列雜交，用激光共聚焦熒光檢測系統或質譜法、化學發光法、光導纖維法等檢測方法檢測其信號強度。該技術主要分為兩種，一種是可視化技術，即將檢測信號通過各種方法擴大，以便達到可視化檢測；另一種是通過提高基因芯片中目的基因載量，該技術在臨床上對疫病高通量檢疫有重要影響。汪琳等[48]利用快速、高效、高通量的基因芯片技術，建立了可同時檢測犬傳染性肝炎病毒、CDV和犬細小病毒的基因芯片篩查檢測方法，該方法對CDV的檢測靈敏度達100 copies，特異性、重復性較好，具有實際應用于口岸檢測的價值。

基因芯片技術通過把大量分子檢測單元集成在一個微小的固體基片表面，可同時對大量的核酸和蛋白質等生物分子實現高效、快速的檢測和分析。但存在技術成本昂貴、復雜、檢測靈敏度較低、重復性差、分析范圍狹窄等不足。

3.5 新型基因測序技術(next generation sequencing technologies,NGS)

NGS是一系列在2004年后問世的新的DNA測序技術，這些新技術依靠高度并行的基因序列讀取方式取得高通量DNA測序，在數天內即可完成第一代基因測序技術花費10年的人類基因組測序。NGS又分為第二代測序和第三代測序，第二代測序以Roche公司的454技術、ABI公司的SOLiD技術和IIIumina公司的Solexa技術為代表。其中454測序的DNA片段無需熒光標記，無需電泳，邊合成邊測序，堿基在加入到序列中時，會脫掉1個焦磷酸，通過檢測焦磷酸識別堿基，因此也被稱為焦磷酸測序。SOLiD以四色熒光標記寡核苷酸的連續連接合成為基礎，可對單copiesDNA片段進行大規模和高通量并行測序。Solexa同樣為邊合成邊測序，該技術在測序的過程中，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP。因為dNTP的羥基末端帶有可化學切割的部分，它只容許每個循環摻入單個堿基，此時，用激光掃描反應板表面，根據dNTP所帶的熒光讀取每條模板序列每1輪反應所聚合上去的核苷酸種類，經過“合成-清洗-拍照”的循環過程，最終得到目的片段的堿基排列順序。

第三代測序以Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術為代表，其技術原理是將含有1對電極的特殊脂質雙分子層置于微孔之上，該雙分子層中含有很多由α溶血素蛋白組成的納米孔，并且每個納米孔會結合1個核酸外切酶。當DNA模板進入孔道時，孔道中的核酸外切酶會“抓住”DNA分子，順序剪切掉穿過納米孔道的DNA堿基，每個堿基通過納米孔時都會產生一個阻斷，根據阻斷電流的變化就能檢測出相應堿基的種類，最終得出DNA分子的序列。Peserico等[49]利用微型納米孔(MinION)測序技術成功讀取病死犬腦組織中的犬瘟熱核酸序列，且與RT-PCR和免疫組化檢測方法具有良好的一致性，該方法通量大、時間短、精確度高、信息量豐富，在臨床診斷中具有非常好的潛在優勢。

新一代基因測序技術相比RT-PCR、熒光定量PCR而言，具有通量大、時間短、精確度高和信息量豐富等優勢，但是成本較高不適宜基層臨床大范圍的推廣使用。

4 展望

診斷準確性高、診斷時間短、多樣品同時診斷、診斷設備簡易且成本低、基層人員即可操作一直是診斷方法的風向標。隨著科學技術的發展，快速、簡便且準確的診斷技術一直在不斷優化，如納米金、核酸適體、CRISPR/Cas技術、微流控芯片、可視化芯片技術、LAMP芯片技術、新型高通量篩查技術、宏基因組學等方法均不斷應用于動物疫病防控、診斷、治療[50-52]，但在犬瘟熱檢測方面的報道研究還很少。對此，我們有以下三點思考：是否可以利用納米金復合物為肉眼可見的紅色斑點這一特性，采用免疫層析技術，制備快速檢測犬瘟熱的納米金試紙條；CRISPR/Cas技術是一種高效簡便、能精準定位并進行基因編輯的技術，是由一種適應性免疫防御機制基礎上發展的新技術，能否利用CRISPR的基因編輯系統，開發用于大熊貓等珍稀動物的犬瘟熱的臨床診斷及治療；能否基于宏基因組學方法建立我市犬瘟熱基因信息文庫，以便高效、快捷地全面分析我市生態環境中犬瘟熱病毒分布情況，實時掌握我市犬瘟熱病毒流行趨勢及防控效果，為疫苗的選擇提供更加準確的數據資料。

快速檢測技術因其低成本、簡便、快速等特點更適合快速篩查和現場檢測，更受寵物醫院、動物園以及疫病檢測部門青睞，是基層有效防治犬瘟熱的技術支撐。但我們認為目前的多種快速診斷方法還應在以下三個方面進行改良：一是國內做快速診斷技術應在確保特異性的前提下進一步提高檢出限(limit of detection，LOD)，提高檢測方法的靈敏度；二是建議將恒溫快速檢測技術與目視熒光試劑結合，在保證不影響擴增反應的前提下，建立更簡便、更直觀、更客觀的結果判定方法；三是應將納米金、核酸適體、CRISPR/Cas技術、微流控芯片、可視化芯片技術、新型高通量篩查技術、宏基因組學等方法應用于犬瘟熱的檢測研究中，綜合多方面技術的優勢，切實建立敏感性高、特異性好、快速簡便且適用于基層快檢或實驗室高通量檢測的診斷方法。