2型糖尿病患者IL-18基因啟動(dòng)子區(qū)-607C/A和-137G/C位點(diǎn)多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性研究

劉 飛,陳靜非(寶雞市中心醫(yī)院.綜合內(nèi)科；.神經(jīng)內(nèi)科一科，陜西寶雞 721000)

頸動(dòng)脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis,CAS)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM) 患者常見(jiàn)的大血管并發(fā)癥之一，同樣也是T2DM患者致殘甚至致死的主要原因[1]。因此探索CAS的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)改善T2DM患者的預(yù)后和提高其生活質(zhì)量具有重要的意義和價(jià)值。白細(xì)胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞促炎因子，其是預(yù)測(cè)斑塊易損性的重要指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)IL-18 可多途徑參與CAS 進(jìn)程，具有較明確的抑制頸動(dòng)脈硬化斑塊的生物學(xué)作用[2-3]。另外近期有學(xué)者指出IL-18 存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)并且其與臨床疾病易感性有關(guān)[4-6]。在IL-18的多個(gè)SNP位點(diǎn)中基因啟動(dòng)子區(qū)-607C/A和-137G/C 關(guān)注較多且生物學(xué)效應(yīng)較明確[7-9]，但是關(guān)于-607C/A和-137G/C位點(diǎn)多態(tài)性與CAS的相關(guān)性研究報(bào)道尚少見(jiàn)，因此本研究著重分析T2DM患者IL-18基因啟動(dòng)子區(qū)-607C/A和-137G/C位點(diǎn)多態(tài)性與CAS的相關(guān)性，旨在為T2DM患者CAS 尋找新的分子遺傳學(xué)標(biāo)記，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年1月～2019年12月寶雞市中心醫(yī)院收治的375例T2DM患者為研究對(duì)象并記為T2DM組，另選擇同期我院體檢健康的200例志愿者作為對(duì)照組。T2DM組中男性207例，女性168例；平均年齡61.98±8.99歲。對(duì)照組中男、女性各100例；平均年齡60.96±7.79歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者自愿參加且均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲者；②T2DM 診斷符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2013年)》[10]上的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；③ 糖尿病病程5年(含5年)以上者；④ 臨床資料完整者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：① 1型糖尿病患者；② 存在其他導(dǎo)致頸動(dòng)脈狹窄的可能因素，例如大動(dòng)脈炎、頸動(dòng)脈夾層、纖維肌肉結(jié)構(gòu)不良、梅毒感染、頭頸部放射治療史等；③并發(fā)嚴(yán)重肝腎疾病或其他系統(tǒng)嚴(yán)重功能障礙者；④并發(fā)惡性腫瘤者；⑤妊娠、哺乳期女性。

1.2 儀器與試劑 應(yīng)用日本東芝公司Aplio 500 彩色多普勒超聲儀測(cè)定CIMT值。采用伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司生產(chǎn)的T100PCR 儀檢測(cè)IL-18基因啟動(dòng)子-607C/A和-137G/C位點(diǎn)基因型。本研究所用引物均由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)提供。

1.3 方法

1.3.1 一般資料采集：主要包括體重指數(shù)（bady mass index,BMI）、吸煙、頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度（carotidintima-media thickness,CIMT）、糖尿病病程、高血壓和血脂異常。

1.3.2 CIMT的測(cè)定：測(cè)定患者雙側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處近端和遠(yuǎn)端各1～1.5 cm 處的CIMT值，記錄CIMT最大值。本研究定義CIMT值＜1 mm表示正常，CIMT ≥1 mm表示CIMT增厚。基于此將T2DM組患者分為2個(gè)亞組：CIMT 正常組(n=122)和CIMT增厚組(n=253)。

1.3.3 IL-18基因啟動(dòng)子-607C/A和-137G/C位點(diǎn)基因型的檢測(cè)：由于兩位點(diǎn)僅相隔470 bp，采用PCR 法同時(shí)擴(kuò)增兩位點(diǎn)后直接測(cè)序分析其相應(yīng)的基因型。上游引物為5’-GACTGCTGTCGGCACTCCT-3’，下游引物為5’-AGCACTTCCAGCCACCCT-3’。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸40 s 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，偏態(tài)分布的資料以中位數(shù)(25%四分位數(shù)～75%四分位數(shù))表示。基因型分布采用Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)。多因素分析采用Logistic回歸分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料的比較 見(jiàn)表1。對(duì)照組和T2DM組的BMI，CIMT 和高血壓差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，兩組吸煙和血脂異常的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。CIMT 正常組和CIMT增厚組在吸煙、CIMT，糖尿病病程方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，兩組BMI，高血壓和血脂異常的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。

2.2 各組IL-18基因啟動(dòng)子區(qū)-607C/A和-137G/C位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較 見(jiàn)表2。對(duì)照組和T2DM組IL-18基因啟動(dòng)子區(qū)-607C/A和-137G/C位點(diǎn)基因型和等位基因型分布頻率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。CIMT 正常組和CIMT增厚組IL-18基因啟動(dòng)子區(qū)-607C/A和-137G/C位點(diǎn)基因型和等位基因型分布頻率的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，兩組-137G/C位點(diǎn)基因型和等位基因型分布頻率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組一般資料的比較

表2 各組-607C/A和-137G/C位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

2.3 T2DM患者CIMT增厚的危險(xiǎn)因素分析 見(jiàn)表3。以吸煙、糖尿病病程和-607C/A(CC vs CA+AA)基因型為自變量，以CIMT增厚為因變量，采用Logistic回歸分析法結(jié)果顯示糖尿病病程和-607C/A(CC vs CA+AA)基因型是T2DM患者CIMT增厚的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 T2DM患者CIMT增厚的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

目前炎癥因子在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，IL-18 作為一種炎性細(xì)胞因子，已有研究指出其與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。2001年MALLAT 等[11]首次在人頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)IL-18 mRNA的存在。在隨后的研究中MALLAT 等[12]還進(jìn)一步證實(shí)IL-18的活性與斑塊不穩(wěn)定性密切相關(guān)。ELHAGE 等[13]研究發(fā)現(xiàn)IL-18基因聯(lián)合apoE 基因敲除小鼠粥樣硬化斑塊面積明顯減小。綜合當(dāng)前研究認(rèn)為IL-18 參與動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制可能是①IL-18 可誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CXCL-16 等，促使血管平滑肌細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白，與動(dòng)脈粥樣硬化起始發(fā)生密切相關(guān)；②IL-18 可誘導(dǎo)γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)分泌，進(jìn)而上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)表達(dá)，抑制平滑肌細(xì)胞合成膠原，促進(jìn)斑塊中纖維降解，導(dǎo)致斑塊破裂；③同時(shí)，IL-18 還可直接激活單核/巨噬細(xì)胞分泌MMP 發(fā)揮作用。

近年來(lái)多項(xiàng)研究報(bào)道指出IL-18基因啟動(dòng)子區(qū)-607C/A和-137G/C 多態(tài)性與冠心病遺傳易感性密切相關(guān)[7-8,14]。Ma 等[14]以中國(guó)人為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)-607C/A CC 基因型發(fā)生冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加2.51倍。RAJESH 等[7]研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者的一級(jí)親屬中攜帶-137G/C GG 基因型是發(fā)生冠心病的高危因素。HOSEINI 等[8]研究結(jié)果顯示-137G/C 基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度相關(guān)。但是關(guān)于-607C/A和-137G/C位點(diǎn)多態(tài)性與CAS的相關(guān)性尚不明確，因此，本研究推測(cè)CAS 與IL-18基因多態(tài)性密切相關(guān)。研究結(jié)果顯示CIMT 正常組與CIMT增厚組在-607C/A 基因型和等位基因型分布頻率組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析顯示-607C/A CC基因型攜帶者CIMT增厚發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可增加2.020倍，但-137G/C位點(diǎn)多態(tài)性與CIMT增厚缺乏關(guān)聯(lián)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)T2DM組與對(duì)照組IL-18基因啟動(dòng)子區(qū)-607C/A和-137G/C位點(diǎn)基因型和等位基因型分布頻率組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-18-607C/A 基因多態(tài)性與CAS 密切相關(guān)，其可顯著增加CIMT增厚的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究尚存在以下缺陷：首先，作為單中心研究，本課題所納入的研究對(duì)象仍相對(duì)較少，期待后續(xù)多中心大樣本及嚴(yán)格設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，考慮T2DM患者動(dòng)脈粥樣硬化的時(shí)間依賴性，本研究納入的T2DM患者均為病程≥5年的患者，使得結(jié)果適用具有一定限制性。最后，限于條件，本研究未能對(duì)納入研究對(duì)象血清IL-18水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)于IL-18基因多態(tài)性如何影響IL-18表達(dá)或活性，繼而發(fā)揮作用，仍有待繼續(xù)研究。