基于分子對接及網絡藥理學初探馬齒莧抗骨質疏松癥“多成分-多靶點”的分子機制

買買提明·努爾買買提，吉米麗汗·司馬依，古麗娜孜·肉孜，海力里·麥麥提，穆妮熱·排爾哈提，優麗吐孜·阿克拉木，阿衣努爾·買提斯迪克*

(1.新疆醫科大學維吾爾醫學院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830011；3.新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院，烏魯木齊 830049)

骨質疏松癥(OP)是一種以骨量減少、骨組織顯微結構退化、可導致骨脆性和骨折危險性增加為特征的全身性代謝性疾病。最新調查研究發現，全球OP患者約有2億人，我國40～49、50～65、65歲以上人群OP患病率分別為3.2%、19.2%、32.0%，OP及其相關的骨折患者達9 000萬，占常見病發病率排名的第7位。每年對OP的治療費用約為250億元，不僅給患者帶來痛苦，也對患者家庭和社會帶來嚴重的經濟負擔。因此，OP的預防和治療是一項急需解決的問題[1-2]。目前，常用的OP療法僅限于改善臨床癥狀，其療效進展緩慢，價格昂貴，且藥物靶向性單一，上述一系列問題急需尋找新思路來解決。研究報道[3-4]，系統性炎癥和氧化應激也是OP的發病機制之一，提供了通過抗炎、抗氧化來治療OP的新思路?，F代中藥藥理學研究發現[5]，中藥防治OP具有獨特的優勢和廣闊的發展前景。

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)分布于世界各地，是我國傳統的藥食兼用1年生草本植物。中醫學認為其具有清熱解毒、涼血止血和止痢等功效。研究發現[6-7]，馬齒莧營養品質高于許多栽培蔬菜，其富含β胡蘿卜素、維生素C和α亞麻酸等，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗衰老、降血脂、松弛骨骼肌、止疼和創口愈合等作用。馬齒莧成分極為復雜，抗OP的機制研究較少。本研究通過網絡藥理學研究方法，科學地篩選馬齒莧的活性成分，系統地揭示馬齒莧通過“多成分-多靶點”治療OP的作用機制，闡述其“多成分-多靶點-多通路”協同作用，為馬齒莧的基礎研究及臨床應用提供科學依據，見圖1。

圖1 基于網絡藥理學的馬齒莧抗OP的藥理學機制示意圖Fig.1 A schematic diagram of the network pharmacology based strategis for determining the pharmacological mechanisms of the Portulaca oleracea L.on OP

1 材料與方法

1.1分析平臺、數據庫和軟件 中藥系統藥理學數據庫(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；中藥綜合數據庫(TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/)；中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[8-10]；蛋白數據庫(Uniprto)(https://www.uniprot.org)；富集分析數據庫(DAVID，V6.8)(https://david.ncifcrf.gov/)；毒性與基因比較數據庫(CTD)(http://ctdbase.org/)；綜合藥物信息數據庫(DrugBank)(https://go.drugbank.com/)；疾病相關的基因與突變位點數據庫(DiSGeNET)(https://www.disgenet.org/search)；治療靶點數據庫(TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)；蛋白結構數據庫(PDB)(http://www.rcsb.org/)；蛋白相互作用網絡數據庫(String)(http://genemania.org/)；網絡可視化軟件(Cytoscape，V3.7.1)(https://cytoscape.org)；三維分子結構軟件(PyMol)(https://pymol.org/)；分子對接軟件(AutoDock Tools，V1.5.6)(http://autodock.scripps.edu)；國家生物技術信息中心(NCBI，PubChem)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；化學成分數據庫(Chemical Book)(https://www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx)。

1.2成分的收集與活性成分的篩選 通過TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM數據庫和分析平臺收集馬齒莧活性成分，根據ADME參數的口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)指標進行篩選。DL是對于某種化合物判斷其是否具有良好的臨床療效相關聯的物理化學性質及生物學特性的指標，DL越大，則成藥性越高。OB是衡量藥物進入人體循環系統有效性的重要指標。良好的OB是化合物具有藥理活性的基本前提。Lipinski指出，ADME參數綜合了藥代動力學性質與藥物的安全性。本研究按照OB≥30%、DL≥0.18條件進行篩選[13-16]。

1.3活性成分作用靶點的預測及篩選 首先，通過TCMSP數據庫收集活性成分對應的靶點。其次，將所有靶點通過Uniprot數據庫以“Homo sapiens”(人屬)為關鍵詞進行基因-蛋白名稱轉化。

1.4OP 特異性靶點的檢索及藥物-疾病共有靶點的分析 首先，利用 “Osteoporosis”作為關鍵詞，檢索及篩選CTD、TTD、DiSGeNET和DrugBank等數據庫，獲得OP的已知靶點。其次，通過String數據庫置信度得分設計閾值(Score值)[17](Score越大，各蛋白之間相互作用表達就越強，Score≥0.9表示最高的置信度)，將蛋白-蛋白相互作用進行分析、篩選并得到OP的特定靶點。最后，對潛在靶點對應的成分進行篩選得到潛在的成分。

1.5分子對接 首先，通過PubChem和Chemical Book數據庫將成分結構進行確證，未找到的化合物用ChemDraw軟件繪制化合物三維結構。其次，蛋白通過PDB數據庫檢索構象并篩選。篩選標準為：(1)通過X晶體衍射法獲取蛋白結構；(2)蛋白的晶體解析度小于3?；(3)明確的蛋白序列和明確的蛋白；(4)自帶小分子配體的蛋白。再次，成分與蛋白進行分子對接。步驟：使用AutoTools加氫去除水分子，對蛋白進行預處理；其次使用AutoGrid進行能量格點計算，有小分子配體的蛋白其活性位點定義在原配體所在的位置，無小分子配體的蛋白，其活性位點由POCASA計算得到；最后使用AutoDock Vina進行小分子與蛋白對接，取優勢構象進行分析，并用Schrodinger可視化。

1.6通路分析與網絡構建 活性成分和作用靶點通過Cytoscape V3.7.1軟件構建“草藥-活性成分-作用靶點”(HB-cC-cT)。String數據庫得到的OP特定靶點構建蛋白-蛋白相互作用網絡圖。潛在成分和潛在靶點構建“草藥-潛在成分-潛在靶點”(HB-pC-pT)網絡圖。用潛在靶點(pT)及其參與的生物學過程(BP)構建了“靶點-生物學”(pT-BP)網絡圖?；虮倔w(GO)生物過程和京都基因與基因組百科全書(KEGG)將潛在靶點通過DAVID數據庫進行GO基因功能和KEGG通路分析。

2 結果

2.1活性成分的篩選結果 TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM數據庫收集的成分分別為54、17、9個。通過TCMSP分析平臺按照ADME的OB和DL參數篩選得到10個成分和394個靶點，見表1。

表1 馬齒莧活性成分的ADME篩選Tab.1 Candidate compounds from Portulaca oleracea L.screened by ADME

2.2活性成分作用靶點的預測與篩選結果 靶點通過Uniprot數據庫進行基因名稱-蛋白名稱轉換，整理后得到208個作用靶點。

2.3HB-cC-cT網絡圖的構建及分析結果 見圖2。由圖2可知，該網絡由219個節點(1個草藥、10個活性成分和208個作用靶點)和379個邊緣組成。四角形(cC)和圓形(cT)之間的邊緣表示相互作用。四角形表示10個活性成分，其中C1表示5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one，圓形表示208個作用靶點。圖形的大小按照網絡拓撲參數自由度(Degree)的大小來決定，Degree與其生物功能呈正比，Degree越大表明其參與的生物功能越多，生物學重要性越強[18]。其中半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位γ亞型(PIK3CK)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、雄激素受體(AR)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)和孕酮受體(PGR)等靶點的Degree較大，表示參與的生物功能越多，其生物學重要性越強。

圖2 “草藥-活性成分-作用靶點”網絡圖Fig.2 HB-cC-cT network

2.4OP特異性靶點的篩選結果 本研究通過CTD、TTD、DrugBank、DiSGeNET等國際公認的疾病靶點數據庫檢索與OP發生、發展密切相關的靶點，結果分別為78、7、13、440個，刪除重復靶點，共檢索到455個靶點。將靶點導入String數據庫篩選得到195個OP特異性靶點，將208個OP特異性靶點與其進行映射，得到32個“藥物-疾病”共有的潛在靶點，見圖3。

圖3 “OP-相關蛋白”相互作用網絡圖Fig.3 "OP-related protein"interaction network

2.5HB-pC-pT 網絡的構建及分析結果 見圖4。由圖4可知，馬齒莧的8個潛在成分作用于32個OP特異性靶點，其中CASP3、轉錄因子AP-1 (JUN)、α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、PTGS2、半胱氨酸蛋白酶-9(CASP9)、凋亡調節因子Bcl-2(BCL2)、半胱氨酸蛋白酶-8(CASP8)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、腫瘤壞死因子(TNF)、AR、血管內皮生長因子A (VEGFA)、DNA拓撲異構酶Ⅱ(TOP2A)、細胞色素氧化酶1B1(CYP1B1)、72 kDaⅣ型膠原酶(MMP2)和凋亡調節劑(BAX)等靶點可能是馬齒莧發揮治療OP作用的關鍵靶點。

圖4 草藥-潛在成分-潛在靶點網絡圖Fig.4 HB-pC-pT network

2.6GO基因功能和KEGG通路分析結果 見圖5。由圖5可知，19個生物過程主要集中在細胞凋亡，包括凋亡過程、凋亡過程的負調控、凋亡過程的正調控、凋亡過程的調控、細胞凋亡的執行期以及內源性凋亡信號途徑等。除此之外，還有炎癥反應、對雌二醇的反應和維生素D代謝過程等生物學過程，與文獻相吻合[3-4]。由此表明，馬齒莧潛在靶點的生物學過程均與OP密切相關。

圖5 馬齒莧治療OP的“靶點-生物學”過程圖Fig.5 pT-BP of Portulaca oleracea L.for treating OP

將32個潛在靶點導入DAVID數據庫分析KEGG信號通路，按照錯誤發現率(FDR)進一步篩選通路，FDR在富集分析中越小，代表富集顯著程度越高。按照FDR≤0.01，共收集了11條主要信號通路，破骨細胞分化、Toll樣受體信號通路、甲狀腺激素信號通路、TGF-β信號通路、細胞因子-細胞因子-受體相互作用、MAPK信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路和JAK-STAT信號通路，見表2。破骨細胞分化的FDR最小，表示富集顯著程度最高，與文獻相吻合[4]。由此表明，馬齒莧不僅可抑制因NO減少而形成的炎癥，還可通過多種通路發揮抗OP作用。

表2 OP特異性靶點的11個顯著的KEGG信號通路Tab.2 Top 11 significantly enriched KEGG pathways in OP specific proteins

2.7分子對接分析結果 通過分子對接進一步驗證了活性成分與其潛在靶點之間的結合方式。研究發現，32個潛在靶點中，8個OP特異性靶點與來自馬齒莧的6個活性成分相互作用，其他24個靶點缺乏合適的蛋白質晶體結構而未被討論。對接得分(Score)表示配體與受體結合的匹配度，Score越大，結合活性和穩定性越好。Score≤-4.25認為配體與靶點具有一定的結合活性；Score≤-5.00認為配體與靶點的結合活性較好；Score≤-7.00認為配體與靶點結合活性更強烈、更穩定[19]。6個活性成分與8個潛在靶點對接結果表明，其中AR、血清白蛋白(ALB)、細胞色素P4501B1(CYP1B1)、PGR和PPARG 5個靶點與6個活性成分具有較好的結合活性，見圖6和表3。

表3 馬齒莧活性成分與潛在靶點的分子對接得分 (Score≤-5.0)Tab.3 Docking scores between active compounds and potential targets of Portulaca oleracea L.(Score≤-5.0)

圖6 馬齒莧活性成分與潛在靶點的分子對接圖Fig.6 Molecular docking map of active components and potential targets in Portulaca oleracea L.

由圖6可知，圖6A是山柰酚結合在AR蛋白的活性位點，有較好的匹配，其酚羥基與THR887氨基酸形成氫鍵相互作用，小分子與TRP741、PHE764、MET745之間形成3個π-π相互作用。圖6B是山柰酚結合在ALB蛋白的活性位點，有較好的匹配，其酚羥基分別與LEU154氨基酸形成氫鍵相互作用，與TYR138氨基酸的苯環形成1個π-π相互作用。圖6C是木犀草素結合在AR蛋白的活性位點，其酚羥基與MET745氨基酸形成氫鍵相互作用，小分子與PHE765之間形成1個π-π相互作用，這些相互作用是促進小分子結合到活性位點的主要結合力。圖6D是槲皮素結合在CYP1B1蛋白的活性位點，小分子與PHE237之間形成1個π-π相互作用。圖6E是5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one結合在PGR蛋白的活性位點，其酚羥基與GLN778氨基酸形成氫鍵相互作用，此外小分子與ASN719和PHE778之間形成2個π-π相互作用。圖6F是花生四烯酸結合在PPARG蛋白的活性位點，其酚羥基分別與HIS448和TYR314氨基酸形成2個氫鍵相互作用。結果表明，氫鍵和π-π相互作用對小分子與蛋白的識別和穩定性起著關鍵作用。成分-靶點網絡分析證實了馬齒莧的活性成分通過與相關蛋白相互作用而發揮抗OP的作用，分析結構進一步闡明了活性化合物與蛋白之間精確的分子機制。

3 結論

馬齒莧的成分較多、藥理作用復雜，對OP的藥理作用機制研究報道較少。T Jin等[20]研究報道，馬齒莧提取物通過抑制脂多糖誘導的巨噬細胞(RAW247.7)產生NO，從而導致炎癥。楊遠超等[21]報道，馬齒莧乙醇提取物對脂多糖誘導的骨質疏松癥小鼠模型骨體積分數、骨小梁數量和骨小梁分離度顯著增高。Kim J Y等研究發現[22]，馬齒莧可通過抑制Akt/GSK3beta-c-Fos-NFATc1信號轉導途徑發揮抗破骨細胞活性。李賽玉等[23]研究發現，馬齒莧可通過抗氧化緩解去卵巢骨量丟失，改善骨代謝。綜上所述，馬齒莧有可能成為治療OP的新天然藥物。

網絡藥理學技術通過預測中藥靶點，擬篩選中藥有效成分及其作用靶點，科學地解釋中藥及復方的藥理作用。通過從已開放的數據庫中收集及篩選治療OP相關的中藥活性成分及其相應的靶點，構建相關調控網絡，確定調控的重要信號通路及子網絡[23-25]。本文通過現有的數據庫、平臺和軟件描述了馬齒莧治療OP的潛在成分以及活性成分與潛在靶點進行分子對接，結合信號通路描述了多成分-多靶點-多通路之間的直接聯系，特別是基因調控、信號傳導通路和細胞因子等方面的機制研究，為后期的實驗提供科學依據。

“草藥-活性成分-作用靶點”網絡中，PTGS1和PTGS2基因都可將花生四烯酸轉化為前列腺素H2，PTGS1參與前列腺素類的產生，而高濃度的前列腺素對分離的破骨細胞有抑制作用[26]。核受體在生物體內分布廣泛，包括配體依賴性核受體(ER、AR)和孤兒核受體(ERRα、PPARG)，其中AR屬于配體依賴的類固醇激素核受體超家族成員[28-29]，AR活性對維持雄性小鼠松質骨發育和骨形成起到重要作用[30]。分子對接結果也表明，山柰酚(Score=-10.7)和木犀草素(Score=-10.7)結合在AR蛋白的活性位點，氫鍵和π-π相互作用對小分子與蛋白的識別和穩定性起著關鍵作用。PPARG或PPARγ的高表達促使骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化，抑制成骨細胞分化而減少成骨細胞生成，在成骨細胞的成熟中起著積極作用[31]，其激動劑可通過MAPK信號通路促進成骨細胞凋亡[32]，抑制PPARG表達，增加成骨細胞數量，提高雄性小鼠骨質量[31]；花生四烯酸(Score=-6.8)結合在PPARG蛋白的活性位點，氫鍵的作用對小分子與蛋白的識別和穩定性起著關鍵作用。研究報道，PPARG的配體通過改變骨髓微環境中細胞因子的水平，而對破骨細胞的分化及功能產生影響[33]。對馬齒莧而言，槲皮素具有雌激素樣作用，通過ER和ERK途徑提高成骨細胞堿性磷酸酶的活性[34]。木犀草素能促進成骨細胞分化和礦化過程[35]。文獻報道，山柰酚能通過刺激雌激素受體增強其活性來促進成骨細胞激活及增殖、分化和礦化的能力[36]，PPARG的配體可對破骨細胞的分化及功能產生影響。本研究表明，馬齒莧的槲皮素、山柰酚、木犀草素、花生四烯酸、5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one和β-谷甾醇等潛在成分能結合在PPARG蛋白的活性位點，但這些成分能否抑制PPARG、增加成骨細胞數量，尚未有研究報道，需要進一步研究。目前，除馬齒莧上述的成分和靶點及其機制外，其余潛在靶點相關研究尚未見報道，這為今后進一步研究馬齒莧的作用機制以及新的適應癥提供了線索。

KEGG通路分析結果表明，馬齒莧通過直接和間接地調節骨代謝信號通路來抗OP。骨吸收和骨形成失衡是OP發生的最重要的發病機制，骨吸收和骨形成是受到相關的骨代謝信號通路的影響，如破骨細胞分化(FDR最小)、TGF-β和MAPK信號通路等。MAPK信號通路參與調控骨細胞的增殖及分化，維持骨代謝[37]；TGF-β信號通路參與骨形成，可促進骨原細胞向軟骨細胞、成骨細胞分化，抑制破骨細胞的活性[38-39]。此外，在顯著富集的信號通路中也存在部分調控其他系統的信號通路，如Toll樣受體信號通路和NOD樣受體信號通路等。研究報道，PI3K可通過激活 Akt，增加Ras同源基因家族A的表達量，從而改變細胞骨架[37]。

本研究結果具備一定的可信度和參考價值，對于相關基礎及臨床實驗的設計、開展能夠起到指導作用。