爐甘石依沙吖啶洗劑含量測定方法的改進(jìn)與長期穩(wěn)定性考察

吳 洋，程 鋼

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230022)

爐甘石依沙吖啶洗劑是皮膚科的常用制劑，在國內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用廣泛[1-3]，成分包括爐甘石、氧化鋅、乳酸依沙吖啶和甘油等，用于治療丘疹、濕疹、蕁麻疹等皮膚炎癥，療效確切；醫(yī)院皮膚科醫(yī)生也經(jīng)常將該制劑作為個體化給藥的基質(zhì)溶液，可添加氯霉素、地塞米松等水針劑，治療其他皮膚疾患，使其適用范圍進(jìn)一步拓展。乳酸依沙吖啶是該制劑的主要成分之一，含量為1 g·L-1，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《安徽省醫(yī)院制劑規(guī)范》1999年版[4]，含量測定方法采用紫外分光光度法(UV法)，本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)方法[1,5-8]的基礎(chǔ)上，建立了高效液相色譜(HPLC)法測定爐甘石依沙吖啶洗劑中乳酸依沙吖啶的含量，并在此基礎(chǔ)上對制劑進(jìn)行12個月的穩(wěn)定性考察，為制劑有效期的確定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀：包括G1310A四元泵、G1314B VWD檢測器、G1379B真空脫氣機(jī)、7725i手動進(jìn)樣器、Agilent 1200化學(xué)工作站(美國Agilent公司)；FA 2004萬分之一電子天平(上海天平儀器廠)；B3200S-T型超聲清洗器(必能信超聲有限公司)；pHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；DH64型電熱恒溫干燥箱(上海醫(yī)療器械七廠)。

1.2試藥 乳酸依沙吖啶對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100290-201002，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.3%)；甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；滅菌注射用水(湖南科倫制藥有限公司)；爐甘石依沙吖啶洗劑(本院制劑室自制，批準(zhǔn)文號：皖藥制字H20070013，批號：20181113、20181212、20190123)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1HPLC法測定乳酸依沙吖啶的含量

2.1.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.5 g·L-1十二烷基磺酸鈉溶液-甲醇(30∶70)(磷酸調(diào)節(jié)pH值為 3.30)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：269 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。理論塔板數(shù)以乳酸依沙吖啶峰計(jì)算不小于3 000。

2.1.2溶液的制備 對照品溶液：精密稱取乳酸依沙吖啶對照品8.75 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，置于50 mL量瓶中，用流動相稀釋到刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為3.30 mg·L-1的對照品溶液。

供試品溶液：精密吸取爐甘石依沙吖啶洗劑2 mL，置于25 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取上述溶液2 mL，置于50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min，吸取上清液，用0.45 μm有機(jī)系濾頭過濾，棄去初濾液，即得。

陰性對照溶液：按照處方配制不含乳酸依沙吖啶的空白爐甘石洗劑，按照上述供試品溶液的制備方法操作，即得。

2.1.3專屬性和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別取2.1.2項(xiàng)下制備的對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，乳酸依沙吖啶峰形良好，保留時(shí)間約為11.5 min，樣品中其他成分和輔料對乳酸依沙吖啶測定無干擾，理論塔板數(shù)按照乳酸依沙吖啶峰計(jì)算不小于3 000。

圖1 HPLC圖A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液；1.乳酸依沙吖啶。Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference soloution；B.sample solution；C.negative control solution;1.ethacridine lactate.

2.1.4線性關(guān)系考察 分別精密量取2.1.2項(xiàng)下制備的對照品儲備液1、2、3、4、5、6 mL，置于100 mL量瓶中，以流動相稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.83、1.65、2.48、3.30、4.12、4.95 mg·L-1的系列對照品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣20 μL，測定峰面積。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=186.95x-0.212 6(r=0.999 9)，線性范圍為0.83～4.95 mg·L-1。

2.1.5精密度實(shí)驗(yàn) 日內(nèi)精密度:分別取2.1.4項(xiàng)下制備的低、中、高質(zhì)量濃度(1.65、3.30、4.95 mg·L-1)的對照品溶液各20 μL，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件各重復(fù)進(jìn)樣3次，進(jìn)樣間隔時(shí)間為4 h，記錄峰面積，計(jì)算低、中、高質(zhì)量濃度的乳酸依沙吖啶的日內(nèi)精密度RSD值，分別為0.85%、0.30%、0.53%(n=3)。

日間精密度：取2.1.4項(xiàng)下制備的低、中、高質(zhì)量濃度(1.65、3.30、4.95 mg·L-1)的對照品溶液各20 μL，每日進(jìn)樣1次，連續(xù)測定3 d，記錄峰面積，計(jì)算低、中、高質(zhì)量濃度的乳酸依沙吖啶的日間精密度RSD值，分別為1.52%、1.30%、1.63%(n=3)。

2.1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.1.2項(xiàng)下制備的供試品溶液，在制備后0、2、4、6、8、12 h各測定1次峰面積，結(jié)果RSD值為0.75%(n=6)，表明供試品溶液在制備后12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號為20181113的爐甘石依沙吖啶洗劑，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算乳酸依沙吖啶含量的RSD值為1.53%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8回收率實(shí)驗(yàn) 按照處方配制不含乳酸依沙吖啶的空白爐甘石洗劑6份，每份10 mL，分別加入乳酸依沙吖啶對照品10.0 mg，搖勻，制得模擬洗劑樣品，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得乳酸依沙吖啶含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.1 Results of recovery test (n=6)

2.1.9樣品含量測定 取爐甘石依沙吖啶洗劑樣品3批，按照2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算乳酸依沙吖啶含量，結(jié)果顯示，3批爐甘石依沙吖啶洗劑中乳酸依沙吖啶的含量分別為0.991、0.980、0.971 g·L-1，3批樣品含量的RSD值分別為0.76%、0.96%、1.53%(n=3)，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中乳酸依沙吖啶的含量限度要求(標(biāo)示量的90.0%～110.0%)。

3 爐甘石依沙吖啶洗劑的長期穩(wěn)定性考察

3.1考察方法與項(xiàng)目 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部9001條規(guī)定，取制劑3批，市售包裝，在室溫(25±2) ℃、相對濕度為60%±10%的條件下避光放置12個月，分別于生產(chǎn)后第0、3、6、9、12個月末取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢測，根據(jù)混懸型洗劑的特點(diǎn)，其重點(diǎn)考察項(xiàng)目確定為性狀、含量、再分散性和沉降體積比[9]。

3.2性狀考察 爐甘石依沙吖啶洗劑的初始性狀為粉紅色帶微黃色混懸液，3批留樣制劑分別于生產(chǎn)后第0、3、6、9、12個月末與同批號原料新鮮配制的爐甘石依沙吖啶洗劑合格品進(jìn)行外觀比色，并觀察是否產(chǎn)生棕色沉淀，結(jié)果見表2。

3.3含量考察 依據(jù)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]，本制劑含鋅化合物以氧化鋅(ZnO)計(jì)不得少于140 g·L-1；含乳酸依沙吖啶(C15H15N3O·C3H6O3)應(yīng)為標(biāo)示量(1 g·L-1)的90.0%～110.0%。按照新建立的HPLC法測定3批留樣制劑第0、3、6、9、12個月末的乳酸依沙吖啶含量；同時(shí)根據(jù)原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測定留樣制劑中的氧化鋅含量，結(jié)果見表2。

3.4再分散性考察 將3批留樣制劑分別取10 mL，置于10 mL具塞量筒中，密封筒口，靜置24 h使其沉降，然后將具塞量筒倒置翻轉(zhuǎn)(一正一反為1次)，記錄沉降物分散完全所需的翻轉(zhuǎn)次數(shù)[3,10]。于第0、3、6、9、12個月末分別取樣測定，結(jié)果見表2。

表2 長期穩(wěn)定性考察結(jié)果(25 ℃，避光)Tab.2 Results of long-term stability study (25 ℃，protected from light)

3.5沉降體積比(F值)測定 將3批留樣制劑分別取10 mL，置于10 mL具塞量筒中，密封筒口，同時(shí)振搖1 min，記錄沉降前原始高度H0，計(jì)時(shí)，于10、30 min及1、2、3、6、24、48 h測定沉降物高度H，計(jì)算F值,F=H÷H0[3,10]。于第0、3、6、9、12個月末分別取樣測定，結(jié)果見表3。

表3 3批留樣制劑的沉降體積比(F值)考察結(jié)果Tab.3 Results of the sedimentation rate (F value) in 3 samples

4 討論

4.1含量測定方法改進(jìn)的必要性 爐甘石依沙吖啶洗劑是醫(yī)院傳統(tǒng)制劑，在皮膚科用藥中有著不可替代的作用。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用UV法測定乳酸依沙吖啶含量，在長期實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，該方法測定結(jié)果偏低，容易對樣品含量造成誤判。究其原因，是因?yàn)樵撝苿┲泻瑺t甘石和氧化鋅固體顆粒，在過濾時(shí)容易對乳酸依沙吖啶產(chǎn)生吸附，雖然用0.05 mol·L-1硫酸溶液沖洗濾紙，但不能完全溶解固體顆粒，導(dǎo)致濾液中乳酸依沙吖啶的含量偏低。冬季因氣溫低，固體顆粒溶解度差，吸附更多，測定結(jié)果經(jīng)常達(dá)不到含量低限，同時(shí)也使長期穩(wěn)定性考察無法順利進(jìn)行。筆者曾參考文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)改良后的UV法[11]，即先用高濃度硫酸溶液(1 mol·L-1)溶解樣品，再用水稀釋定容后過濾，方法回收率有所提高，但仍無法解決冬季含量偏低的問題，由此可見，改進(jìn)其含量測定方法是十分必要的。

4.2HPLC色譜條件的優(yōu)化及方法的優(yōu)點(diǎn) 有關(guān)HPLC法測定乳酸依沙吖啶原料及其制劑的含量已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[1,7-10]，筆者以甲醇-乙腈-水(60∶37∶3)以及含1 g·L-1庚烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液∶乙腈(70∶30)為流動相[1]，并試用Agilent Eclipse XDB-C18和Diamonsil C182種色譜柱，均產(chǎn)生較嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，因乳酸依沙吖啶具有2個芳香胺基結(jié)構(gòu)，C18對其有強(qiáng)保留，甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)均較難洗脫[5]，采用0.5 g·L-1十二烷基磺酸鈉溶液-甲醇(30∶70)(磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.30)流動相較易洗脫，峰形良好。本研究中樣品前處理采用2步稀釋，較好地解決了固體顆粒的吸附問題，雖然未用硫酸液溶解爐甘石和氧化鋅顆粒，但第2步稀釋后樣品濃度已降低300倍以上，靜置后取上清液過濾，固體顆粒對乳酸依沙吖啶的吸附可忽略不計(jì)。該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可較好地控制制劑質(zhì)量。

4.3長期穩(wěn)定性考察結(jié)果分析 爐甘石依沙吖啶洗劑在臨床使用已超過30年，生產(chǎn)工藝成熟，安全性、有效性均有保障，制劑中乳酸依沙吖啶易見光分解使混懸液變色甚至產(chǎn)生沉淀，故成品采用聚乙烯瓶加紙盒避光包裝，在穩(wěn)定性考察中未再進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)和影響因素實(shí)驗(yàn)(如光照等)。由表3和表4可知，在12個月內(nèi)，3批樣品的性狀、含量、沉降體積比變化不大，每個考察時(shí)間點(diǎn)48 h內(nèi)沉降速率基本一致，說明混懸液穩(wěn)定性未發(fā)生改變；重新翻轉(zhuǎn)次數(shù)在3、6、9、12個月末與考察初期基本一致，說明混懸液未形成不易分散的結(jié)塊，再分散性較好。含量測定結(jié)果表明，3批留樣制劑12個月內(nèi)含量變化很小(<1.0%)，說明室溫條件下藥物穩(wěn)定，根據(jù)《中國藥典》2015年版規(guī)定，未做95%可信限統(tǒng)計(jì)分析[9]。綜上所述，爐甘石依沙吖啶洗劑在12個月內(nèi)穩(wěn)定性好，藥品說明書中標(biāo)注的1年有效期切實(shí)可行。

4.4爐甘石原料的現(xiàn)狀及對制劑質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響 爐甘石屬礦物類中藥材，《中國藥典》2015年版一部規(guī)定其基源為碳酸鹽類礦物方解石菱鋅礦，主含碳酸鋅[12]，臨床應(yīng)用需經(jīng)煅制、水飛炮制后方可使用，但礦物藥作為不可再生資源，隨著不斷開采，我國的少數(shù)幾個菱鋅礦已日漸枯竭，而市場用量在不斷增大，供需矛盾使?fàn)t甘石市場偽品率日漸增高，近年來已達(dá)60%以上[13]。為保護(hù)自然資源，同時(shí)保證爐甘石的可持續(xù)供應(yīng)，國內(nèi)多年來一直在開展人工合成爐甘石的研究和實(shí)踐。研究表明，爐甘石的藥理作用與其成分與粒度相關(guān)，顆粒越小，抑菌性和收斂性越強(qiáng)[14-15]，爐甘石所含成分中抑菌活性強(qiáng)弱為Zn5(CO3)2(OH)6>ZnO>ZnCO3，生品含Zn5(CO3)2(OH)6較多，炮制品因經(jīng)過煅燒，Zn5(CO3)2(OH)6等分解成ZnO，但因粒徑變小，抑菌效果強(qiáng)于生品[16]。化學(xué)合成爐甘石粉是通過硫酸鋅和碳酸氫銨或碳酸鈉合成Zn5(CO3)2(OH)6，干燥后再添加少量氧化鐵著色而成[17]，其特點(diǎn)是既保持了與生品相同的主成分和抗菌活性，又保持了與炮制品相似的較小粒度，還避免了天然藥物中鉛、鎘等毒性元素的危害。隨著合成工藝的提高，爐甘石粉的質(zhì)量不斷提升，化學(xué)合成品在國內(nèi)爐甘石原料藥市場占比越來越高。

國內(nèi)生產(chǎn)爐甘石粉有3個廠家，分別為上海某廠、湖南某廠和南昌某廠，我單位在配制制劑時(shí)均有應(yīng)用。3個廠家產(chǎn)品的顏色、性狀和粒度各不相同，湖南廠家顏色淺、粒度細(xì)，南昌廠家顏色深、粒度大，上海廠家居中。在臨床應(yīng)用和穩(wěn)定性考察中獲知，南昌廠家原料因顆粒較粗，配制的制劑用于皮膚時(shí)砂礫感較強(qiáng)，患者不易接受；湖南廠家原料最細(xì)膩，配制的制劑基本無皮膚刺激感，在穩(wěn)定性考察中，F(xiàn)值較大，初配成的混懸液穩(wěn)定性好，但由于粉末太細(xì)，一旦與氧化鋅聚合則不易分離，在長期貯存時(shí)，容易產(chǎn)生黏壁和瓶底板結(jié)現(xiàn)象，再分散性不好。因此，本研究選用上海廠家的原料進(jìn)行了長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，這也是在不改變處方前提下的相對最佳結(jié)果。也有文獻(xiàn)報(bào)道，爐甘石洗劑中加入卡波姆、羥丙甲基纖維素、殼聚糖等新型無毒助懸劑，可較好地改變混懸劑的穩(wěn)定性[18-20]，改善黏壁和板結(jié)現(xiàn)象，這也是今后改良處方、提高制劑質(zhì)量、進(jìn)一步滿足患者需求的研究方向。