傅立葉變換離子回旋共振質譜及其在藥學領域的應用

張藝馨 張筱宜 王玉記 王耀楠 趙 明

(首都醫科大學藥學院， 北京 100069)

傅立葉變換離子回旋共振質譜儀 (fourier transformion ion cyclotron resonance mass spectrometry, FT-ICR MS) 是基于測量磁場中離子回旋頻率而獲得離子質荷比信息的分析儀器。自1974 年Comisarow 和Marshall[1]發明的第一臺FT-ICR MS儀器以來，其超高的分辨率(>1000000)、高質量精度(<1μppm)等分析特性，使它成為代謝組學、蛋白質組學、石油組學和復雜混合物研究的重要工具[2]。此外，它還可以與多種解離機制進行兼容，包括碰撞誘導解離(collision induced dissociation，CID)、紅外多光子解離(infrared multiphoton dissociation，IRMPD)和電子捕獲解離(electron capture dissociation，ECD)等，使FT-ICR MS成為大型復雜分子串聯質譜分析的理想選擇[3]。

1 傅立葉變換離子回旋共振質譜

1.1 儀器構成

FT-ICR MS包括進樣系統、離子源、超導磁體、ICR分析池、數據處理系統等。為了確保ICR分析池中所需的<10-8托(Torr)的真空度，離子源通常放置在ICR分析池外部，之后離子再通過離子光學器件傳輸到分析池[4]。離子光學器件通常由形成多級電場的電極組成，通過對其電壓進行控制，以確保離子在1道爾頓(Dalton，Da)或更小的質量窗口內的軌跡穩定性。此外，FT-ICR MS幾乎可與所有離子源結合使用，包括電子轟擊電離(electron impact ionization，EI)，化學電離(chemical ionization, CI)，快原子轟擊(fast atom bombardment, FAB)，電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)，基質輔助激光解吸電離 (matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)以及亞穩原子轟擊[5](metastable atom bombardment，MAB)等，使FT-ICR MS可廣泛適用于各種樣品[6]。

ICR分析池是FT-ICR MS的核心部件，由捕獲電極(trapping electrodes)、激發電極(excitation electrodes)和檢測電極(detection electrodes)3對電極組成，如圖1所示。其中，捕獲電極用于軸向捕獲離子；激發電極將離子激發到大的回旋半徑；檢測電極則用來檢測離子運動產生的鏡像電流。

圖1 ICR分析池示意圖

1.2 基本原理

FT-ICR MS的工作原理是測量均勻磁場中離子運動的頻率，并將其轉換為質荷比(m/z)。離子在磁場在中做圓周運動，其頻率可表示為：

ωc=qB/m

其中ωc為回旋頻率，q為離子電荷，B為磁場強度，m為離子質量[7]。

離子的激發和檢測都是在ICR分析池內完成的，其運動可以描述為：離子以較低的動能進入分析池，在沿磁場矢量的方向上被捕獲電極捕獲，但是離子的初始回旋半徑很小，為了檢測到信號，在離子回旋運動平面上施加含有共振頻率的射頻電場，進而激發離子的同步回旋運動，之后旋轉離子在檢測電極中感應出圖像電荷，從而在信號放大器的電路中產生鏡像電流，該電流可以被放大并轉換為間隔采樣的數字信號，通過對時域信號進行傅里葉變換，即可得到頻譜，最終轉換為m/z[2]。圖2為FT-ICR MS采集和獲取質譜數據的過程。

圖2 FT-ICR MS工作流程示意圖[8]

1.3 串聯質譜

為了獲得更多的結構信息，通常通過多級質譜聯用將分析物進一步裂解。串聯質譜的分析結果受分離過程中各種解離方式的影響[9]，FT-ICR MS主要支持三種解離方式：CID、IRMPD以及ECD。CID是FT-ICR MS最常用的解離方式，其通過離子與中性氣體之間發生非彈性碰撞，從而導致離子中解離能最低的鍵斷裂[10]。IRMPD產生的裂解譜類似于CID，但是不需要破壞真空條件的氣體脈沖[11]。另一種新開發的解離方式是ECD，在多肽和蛋白質的測序中具有顯著的優勢。它的原理是利用電子俘獲時的能量增益來裂解肽鍵，而不是在化合物結構中解離能最低的鍵上發生斷裂，從而不會丟失諸如糖基化和羧基化這樣的翻譯后修飾，可以提供更多的序列信息12, 13]。

2 傅立葉變換離子回旋共振質譜法在藥學領域的應用

2.1 結構鑒定和元素分析

結構鑒定是藥物分析的首要環節，而準確的質量測定需要盡可能高的分辨率。FT-ICR MS具有超高的質量精度和分辨率，可以確保未知物檢測的準確性與重復性，從而提供準確的質量分析。Wu[14]等利用高效液相色譜-紫外檢測器(HPLC-UV )-FT-ICR MS對鹽酸莫西沙星進行了質譜分析，首次篩查發現5種新雜質，并對其中3種進行了結構確證。FT-ICR MS也可用于鑒定分子的自組裝結構，為納米粒子結構表征提供依據。Zhang[15]等通過FT-ICR MS，發現ICCA-WFF自組裝形成三聚體結構。如圖3所示，譜圖中可以看到目標化合物(分子量為810)在809.34135、1619.69296、1214.52111的陰離子峰，分別為目標化合物單體、二聚體及三聚體的質譜歸屬。由于FT-ICR MS可以有效識別13C、15N、34S和18O的同位素精細結構，因此，它還可作為含雜原子化合物峰特異性挑選和元素組成測定的理想工具[16]。Miura[17]等提出了一種利用FT-ICR-MS對化合物進行元素分析的策略。在這項研究中，通過解析3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)和3,9-雙[2-(3,5-二氨基-2,4,6-三氮雜苯基)乙基]-2,4,8,10-四氧雜螺[5.5]十一烷(CTU Guanamine)的同位素精細結構和峰面積的信息，進行元素的定量分析，計算結果與模擬數據均吻合良好。此外，FT-ICR MS還可以應用于小分子化合物的結構解析。MALDI譜圖的低m/z區域(m/z<1000)通常包含大量來自組織樣本內源性化合物的離子，而FT-ICR MS可以從眾多的化學背景中區分出目標化合物，確定小分子的元素組成，在小分子藥物及其代謝產物結構鑒定等領域具有一定優勢[18]。

圖3 ICCA-WFF的FT-ICR-MS譜圖[15]

2.2 藥物代謝與代謝組學

藥物代謝研究是當今藥物研發的重要組成部分，代謝物的鑒定對了解候選藥物的代謝途徑、毒理學研究和藥效譜的優化至關重要[19]。FT-ICR MS的高質量分辨率、質量精度和動態范圍，使其成為鑒定復雜生物樣品代謝產物及進行代謝組學研究的有力工具。Yao[20]等利用超高效液相色譜(UHPLC)-FT-ICR MS 對口服帕博西尼(Palbociclib)的大鼠模型進行了代謝組學的研究，在尿液、糞便和膽汁樣品中共檢測和鑒定了29種代謝物，代謝途徑包括羥基化、氧化、脫氫、N-脫烷基、羰基化、氧化脫氨、乙?；⑵咸烟侨┧峄?、硫酸鹽結合以及體內多種交叉代謝途徑等，為日后的研究提供了相關的化學信息。此外，FT-ICR MS還可以確定化合物的靶向作用及釋放過程。本課題組利用ESI(+)-FT-MS對S180小鼠的腫瘤組織、臟器提取物以及血漿中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-吉西他濱(RGDV-吉西他濱)進行了質譜分析。在腫瘤組織提取物和血漿中觀察到了RGDV-吉西他濱的離子峰，并且在腫瘤組織的提取物中可以看到目標化合物降解結構的離子峰，而血漿中并沒有。表明RGDV-吉西他濱能夠靶向腫瘤組織，并且在血液循環的過程中不被降解21]。在代謝組學研究中，FT-ICR MS還可檢測疾病的相關生物標志物。Liu[22]等使用UHPLC-FT-ICR-MS研究了三種不同方法誘發的發熱大鼠的血漿代謝物，研究結果表明，三種不同方法引起大鼠發熱的生物學過程不同，特異性的生物標志物可以區分不同方法引起的發熱，為今后臨床上發熱的診斷和治療奠定了一定基礎。

2.3 中草藥復雜體系

區別于化學藥物，通常每種中藥中都含有大量的化學成分，為了進一步深入中藥的藥理研究，提高中藥材的質量控制，需要高效靈敏的檢測技術對中藥的有效成分進行分析和表征。FT-ICR MS另一個顯著的特點是無需分離即可測定混合物中的大多數化合物，使其在中草藥復雜體系的研究中顯示出了巨大優勢。Park[23]等通過15 特斯拉(T)FT-ICR MS對人參提取物中的天然化合物進行質譜分析，確定了123種人參化合物的分子式，其中包括33種人參皂苷。Cui[24]等利用UHPLC-FT-ICR-MS對甘遂半夏湯中的化學成分進行了檢測，初步鑒定了62種成分，包括二萜、三萜、單萜、生物堿、類黃酮及其糖苷，為進一步研究該中藥配方提供了化學依據。Han[25]等通過UHPLC-FT-ICR MS / MS初步鑒定了紅景天提取物中64種化學成分，并在口服紅景天后的大鼠血漿和腦組織中分別檢測到24種和9種化學成分，所建立的UHPLC-FT-ICR MS/MS方法適用于中藥的體內外化學成分的鑒定和表征，此外，通過研究藥效成分在腦內的空間分布，可以進一步闡明中草藥的治療基礎和作用機理。

2.4 蛋白質組學

FT-ICR-MS能夠準確測定蛋白質中多肽鏈的數目和各肽段的氨基酸序列，還可以分析蛋白質翻譯后修飾以及位點的特異性表征，從而實現對復雜生物樣品中蛋白質的鑒定[26]。此外，多電荷完整蛋白質主要出現在1000～5000 m/z的窗口，而FT-ICR MS在該質量范圍內可以獲得6000000的分辨率，這使得該技術非常適合于蛋白質大分子的研究[11]。Anderson[27]等利用21 T的液相色譜(LC)-FT-ICR MS / MS對人結直腸癌細胞裂解物中提取的完整蛋白質進行了自上而下的蛋白質組學研究，鑒定出了372個大于30 kDa的蛋白形式，大大擴展了LC-MS / MS的可及質量范圍。Burgt[28]等利用基質輔助激光解吸電離-源內衰減(MALDI-ISD) FT-ICR MS對單克隆抗體進行了質譜分析，蛋白質的深層結構信息可從超高分辨率MALDI-ISD譜圖中獲得，實現了針對單克隆抗體廣泛的、可靠的結構表征。Anderson29]等通過21 T LC-FT-ICR MS的ETD / CID串聯質譜對線粒體支鏈氨基轉移酶(BCAT2)及其天然變體進行了自上而下的蛋白質分析，確定了BCAT2的變異位點，從而為基于片段的藥物設計提供治療靶點。此外，在質譜分析的結果中，ETD覆蓋了蛋白質的N端和C端區域，而CID覆蓋了更多的中心區域，這表明不同裂解技術的互補性及實用性。

3 展望

FT-ICR MS的超高分辨率和質量精度，使其在復雜混合物的元素鑒定和結構表征中展現出了巨大的潛力和優勢，并發展成為分析化學藥品、中草藥體系、生物大分子等復雜樣品的強大工具。作為一種分析技術，FT-ICR MS仍在開發之中，增加電磁振蕩頻率可以提高FT-ICR MS儀器的性能，因此對超導磁體提出了更高的要求，相應的，也應進一步優化數據處理系統以用于樣品高通量的鑒定，但是另一方面，儀器高昂的成本一定程度上也限制了其推廣，為了應對這一挑戰，應重視技術革新來降低其運行成本。例如可提高超低溫泵中液氦的回收效率，以減少液氦裝填次數，節約成本。此外，FT-ICR MS儀器的操作和數據分析方面專業技能的培訓也是實現FT-ICR高性能的關鍵。相信隨著該設備的普及，FT-ICR MS必定會在生物醫藥領域得到更充分的應用。

致謝

本論文是在2020年北京高等學校高水平人才交叉培養“實培計劃”項目和2020年度首都醫科大學科研訓練項目資助下完成的。感謝多肽及小分子藥物北京市重點實驗室和內源式預防藥物教育部工程研究中心。