高濃度啤酒釀造特性的研究概況

崔云前，孟飛，杜俊杰，吉春暉，周長生

1. 齊魯工業大學生物工程學院，山東省微生物工程重點實驗室（濟南 250353）；2. 菏澤聚鑫源食品有限公司（菏澤 274400）

高濃度啤酒需要利用高濃度的麥汁（麥汁濃度≥15 °P）及高耐性的酵母進行釀造，而且普遍將高于18 °P麥汁濃度的啤酒稱為高濃度啤酒，酒精含量大于5%vol的啤酒稱為高酒精度啤酒[1]。雖然其酒精度略微偏高，但風味獨特、營養豐富、口感上佳，具有十分高的飲用價值。在高濃度啤酒釀造中，啤酒酵母是重要因素，直接影響成品啤酒的品質。酵母在高濃度麥汁發酵過程中會受到多個因素的影響，包括發酵初期高濃度的糖含量及低溶氧、發酵后期的高酒精含量等，這些均會影響酵母的生理狀態和發酵性能，造成啤酒的口感及品質不佳。此外，高濃度麥汁的制備和發酵過程的控制等對高濃度啤酒的品質也起著至關重要的影響。

近幾年，精釀啤酒在國內蓬勃發展，中高端啤酒的銷售量持續增長，啤酒消費者對產品的品質與創新性的要求不斷增高。不過考慮到釀造技術及生產成本的原因，我國生產的啤酒仍然以中低端、口感清淡（原麥汁濃度≤15 °P）為主，高濃度啤酒占小部分市場，啤酒種類也相對單一。以高麥汁濃度、高酒精含量啤酒為主的高端市場被國外啤酒所占據。因此，若要增強國內啤酒在中高端市場的競爭力，對醇厚濃烈、種類多樣的高濃度啤酒的研究有重要意義。

1 高濃度發酵對酵母的影響

1.1 對酵母的生理狀態影響

在高濃度發酵的整個過程中，發酵初期高濃度的糖分和發酵中后期較高的酒精含量均會對酵母細胞產生較大的滲透壓：在發酵前麥汁的滲透壓達150 Psi以上，在發酵結束時的滲透壓可以到450 Psi以上，酒精含量在6%以上[2]。滲透壓的增加會引起環境中水含量降低，所以會造成一定程度的生理干燥。因為較高的酒精含量導致酵母細胞產生嚴重毒性：酵母細胞膜的通透性會由于高的酒精含量發生改變，使細胞膜對H+的透過性加強，細胞質的pH下降，由此改變了酵母細胞的活性和生理狀態，降低了糖代謝能力，細胞的活力也會減弱，細胞的生長得到限制。所以，在高酒精含量及高滲透壓的環境影響下啤酒酵母的發酵度、酒精生成量及發酵速度均會隨之降低，從而影響經濟利潤[3]。

1.2 對酵母碳源物質代謝的影響

碳水化合物占麥汁的90%～93%。其中異麥芽糖、戊糖、低聚糊精等不可發酵性糖占26%左右，這些物質不能被酵母分解利用，不過會明顯影響到成品啤酒的品質。在約75%的可發酵糖中，葡萄糖、麥芽糖與麥芽三糖的含量最高，依次占有60%～65%，20%～25%與10%～15%，果糖與蔗糖的含量相對來說微乎其微[4]。研究表明，麥汁中糖類每個組分的減少或者增加可能會同時改變麥汁可發酵性糖的比例，從而影響酵母的糖代謝能力[5]。到目前為止，一些啤酒釀造公司普遍都是通過添加適當比例的輔料來制備較高濃度的麥汁，常用輔料包括大米、玉米淀粉及麥芽糖漿等，所以麥汁中糖類的組分發生比較顯著的改變。Rautio等[6]研究表明，如果在麥汁中葡萄糖的比例較高，則酵母的麥芽糖轉運酶活性會明顯地受到抑制，隨著葡萄糖與麥芽糖的比例下降，葡萄糖對麥芽糖的阻遏效應會出現減緩，麥芽糖轉運酶的活力得到提升。不過在發酵的后期，麥芽糖代謝基因的表達量會迅速下降。研究表明葡萄糖與麥芽糖的比例太大或者太小均會對酵母的糖代謝能力產生一定的負面作用。

1.3 對酵母氮源物質代謝的影響

酵母的發酵性能及啤酒品質的穩定性不能僅僅依靠麥汁中的糖類組分。在啤酒的發酵階段，酵母還需要利用麥汁里的含氮物質來合成細胞自身的核酸、蛋白質等含氮化合物，進而完成細胞的增殖[7]。不過酵母并不是可以吸收并利用所有的含氮物質。酵母可以吸收并利用的含氮化合物稱之為游離氨基氮，即銨離子、小分子肽與游離氨基酸的總稱，被視為是在啤酒的釀造中表達酵母可同化氮水平的重要指標[8]。若可同化氮的含量充沛，酵母的降糖速度與增殖速度就會加快，若含量偏少，則會導致酵母提前進入衰老狀態。在高濃度啤酒的發酵過程中，需要更多的游離氮用來平衡高滲透壓及其他的環境壓力，并且加入一定比例的輔料使麥汁中游離氨基氮含量下降，因此對酵母的發酵性能產生影響。所以，在增加麥汁濃度的同時還需要注意游離氨基氮含量的增加，進而使糖代謝能力保持正常，維持較強的細胞活性。Conner等[9]研究得出，在高濃度發酵中的麥汁初始游離氨基氮的含量與酵母的增殖速率有較高的相關性。麥汁中游離氨基氮的含量從160 mg/L增至410 mg/L后，酵母的降糖速率及增殖速率均顯著增強，并且酒精的含量增加了約75%。

2 高濃度啤酒酵母的選育

酵母作為啤酒的“靈魂”，對啤酒的風味及品質有著至關重要的影響。酵母在高濃度麥汁中會受到高滲透壓和高酒精含量的影響，選育出合適的酵母是進行高濃度啤酒發酵的關鍵。這類酵母需要擁有較好的耐高酒精含量及耐高滲透壓的能力，具有良好的發酵性能，這樣才可以確保成品啤酒的風味與品質的穩定性[10]。

目前，很少有與高濃度發酵啤酒酵母選育相關的研究報告，普遍應用的技術包括化學誘變、物理誘變、連續培養選擇等方法。凌猛等[11]用啤酒酵母X作出發菌株，以生化方式進行連續篩選，得到耐高酒精含量（18%）、耐高滲透壓（糖度60%）的啤酒酵母Y。這個酵母在28 °P高濃度麥汁中進行發酵，發酵度和出發菌株比較增加了3.5%，并且風味的組合也更加協調；Lies等[12]利用高濃度馴化結合紫外誘變技術的方法，得到一株在18 °P高濃度的麥汁中有良好發酵性能的啤酒酵母菌株，12℃發酵結束后酒精度為8.2%vol，比出發酵母菌株增加了5.2%。Huuskonen等[13]采用EMS誘變方法對發酵結束之后的酵母菌株進行處理，接著連續培養選擇（持續地往麥汁中加入麥芽糖與麥芽三糖，直到大多數酵母細胞失去活性），所得到的酵母菌株發酵性有明顯的改善，它的發酵速度相對于出發菌株增加了10%～30%，發酵得更加徹底，并且酵母的絮凝性和親代相似。Mizuno等[14]應用培養基篩選的方法，在培養基中加入適量2-去氧-D葡萄糖（2-DOG），然后進行優勝劣汰的選擇，最終得到一株可以抑制葡萄糖阻遏效應的酵母菌株，在20 °P的超高濃度麥汁中發酵酒精度可達到9.9%vol，相對于出發酵母菌株增加了12.5%。

雖然以上研究利用誘變技術和連續培養選擇等方法，得到的酵母菌株可以進行高濃度啤酒的釀造，不過截至目前，并沒有專用酵母可以完全適用于高濃度啤酒的生產。所以，需要嘗試對傳統的誘變育種等方法進行改進，合理地利用好基因工程技術的優勢，潛心于組建適合高濃度啤酒釀造的基因工程菌種探究，期望獲得一株耐高滲透壓、耐高酒精度、副產物的產率高及穩定性強的酵母菌株，進而實現高濃度啤酒的大規模生產。

3 高濃度麥汁的制備

高濃度麥汁的制備，需要高質量的麥芽才能制備高濃度的麥汁。溶解度好、糖化力強的麥芽，能夠將淀粉更佳地水解為可供酵母吸收利用的糖，而且得到的麥汁中含有更高的游離氨基氮。增加游離氨基氮與可發酵性糖含量的同時有效避免酵母細胞活力低造成的發酵緩慢，得到更加高的酒精產量，降低能源消耗、勞動力等，以獲得更多的經濟利潤。

通過研究得出，最佳制備高濃度麥汁的方式有：1）添加各種糖漿以獲得高濃度麥汁；2）增加煮沸時間或者增加麥芽的使用量。對于前者，如果在煮沸結束之前加入糖漿，能夠很好地避免過濾及攪拌等問題，不過糖漿的種類和添加量會對麥汁品質造成影響，包括使游離氨基氮含量下降及可發酵性糖的比例發生改變。想要獲得高濃度的麥汁，需要在增加麥芽使用量時把控好料水比，在煮沸結束之前投入適量的糖漿[10]。后者因為增加了麥芽使用量，導致糊化與糖化醪黏度增加，使過濾與攪拌受阻，并且增加了煮沸時間，加大了能源消耗。

4 高濃度啤酒發酵過程的控制

國內外研究者提出多種通過途徑對發酵過程的控制來解決釀造高濃度啤酒的困難，如提高酵母接種量、補充酵母營養物質、調節溶氧量等。Nguyen等[15]研究表明，增加酵母的接種量會使發酵液酵母細胞數得到增加，乙醇生產速率和糖的利用率也會升高，不過啤酒的雙乙酰水平也會同時提高。研究結果還顯示，只利用增加接種量的方式，要比往麥汁里加入營養物質效果更佳（酵母提取物及吐溫80）或者將這兩種方法共同進行，糖的攝入量、雙乙酰含量、乙醇生產速率及酒精含量均是評價的指標[16]。Erten等[17]表明，增加酵母接種量會使發酵速率加快，2-甲基-1丙醇的含量同時也會增加，而2-及3-甲基-1-丁醇的含量減少。不過Verbelen等[18]研究表明，風味物質的產生沒有因接種量受到明顯的影響，不過雙乙酰的含量會明顯增加。

在啤酒的發酵階段，酵母的生理活性和發酵性能受到溶氧量的顯著影響。氧對甾醇及不和飽和脂肪酸的合成有促進作用。并且甾醇是酵母細胞膜的重要成分，充足的麥角甾醇對細胞生長有明顯的促進作用，對保持細胞膜的滲透性、流動性以及細胞膜功能的完整性也有顯著影響[19]。另外，研究發現線粒體基質中的含錳超氧化物歧化物和酵母對酒精的耐受性有密切聯系，然而氧和其合成緊密相關。若在發酵階段不能對酵母提供充足的氧，對其增殖會造成負面作用，酵母對高酒精度、高滲透壓的耐受性下降，進而造成發酵速率下降或減緩。在高濃度啤酒釀造中，因其麥汁濃度的提高，造成麥汁的飽和溶氧量下降，然而相比于常規發酵，高濃度釀造中酵母對氧的需求量更高。因此在高濃度發酵過程中，需要增加麥汁的溶氧量，以確保在酵母增殖期間能夠提供充足的氧。Heather等[20]研究表明，如果供氧濃度和時間可以合理有效地控制，發酵周期能夠明顯縮減，可提高生產效率，降低物質消耗。Rees等[21]分別研究了12 °P麥汁與20 °P麥汁中不同含量的鋅離子對酒精含量及酵母發酵能力的影響，結果發現，酵母種類、麥汁濃度大小等因素會影響鋅離子對酵母的發酵能力，提升高濃度麥汁中的鋅離子含量對于提高酒精含量和酵母的發酵速率起到正面影響。

此外，高濃度發酵比常規發酵產生更多的泡沫，會造成發酵罐的容積率下降，導致不必要的泡沫損失。有關研究表示，可以在發酵階段通過變溫控制來處理這一問題，即發酵初期就使用低溫發酵直至高泡期，等高泡期過后，再升到正常發酵溫度[22]。

5 結語

研究高濃度釀造對酵母的生理狀態、發酵性能及胞內代謝情況產生的影響，可為確保選育優良的高濃釀造菌株提供根本的理論依據。酵母菌株的選育、麥芽汁的制備和發酵過程的控制是影響高濃度啤酒釀造的重要因素，引起了國內外研究者的廣泛關注。但在實際生產中，還會受到原料的選擇、糖化溫度與時間的確定以及代謝副產物等的影響，因此還需要對高濃度啤酒釀造的影響因素進一步研究，以期生產更高品質的啤酒。