一株犢牛腹瀉綠膿桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

郝安琦，耿兆楠，孫福亮

延邊大學農學院動物醫學系，吉林延吉 133000

綠膿桿菌，又名銅綠假單胞菌,是一種革蘭氏陰性需氧桿菌，在1882年由Gersard氏從傷口膿液中分離得到。綠膿桿菌在自然界中分布廣泛，水、土壤、腸胃內容物中均存在。雞、鴨、兔、牛、馬、羊、鵪鶉、水貂、熊貓等動物均可被感染，不同動物感染綠膿桿菌所表現的病癥有差異。研究發現：綠膿桿菌可能導致狐貍流產、子宮化膿[1]；羊慢性化膿性肺炎[2]；水貂出血性肺炎[3]等疾病。牛感染綠膿桿菌多見臨床表現為肺炎[4]或腹瀉。為了解及確定延邊州某養殖場犢牛腹瀉病原菌，本文采用了形態學觀察、革蘭氏染色觀察、生化試驗、分子生物學鑒定、藥敏試驗等方法確定了該病原菌為綠膿桿菌。

1 材料

1.1 病料來源

采集于延邊州某養殖場腹瀉犢牛糞便。

1.2 主要試劑

血瓊脂培養基、LB固體培養基、LB液體培養基、生化試驗試劑盒、常用抗生素藥敏紙片、革蘭氏染色劑、瓊脂糖、PCR擴增試劑盒。

2 方法

2.1 細菌的分離

糞便稀釋后分別涂布于血瓊脂平板和普通LB固體平板上，置于37 ℃培養箱內培養12 h后挑取單個菌落劃線培養純化。

2.2 細菌的鑒定

2.2.1 形態學觀察

挑取培養基上生長的單個菌落，革蘭氏染色后鏡下觀察其形態特征。

2.2.2 生化試驗

糖類發酵試驗、氧化酶試驗、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、尿素水解試驗、硫化氫試驗、V-P試驗和吲哚試驗。

2.2.3 分子生物學試驗

取典型菌落，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳試驗，提取PCR純化產物后后送至長春生工公司進行測序。

2.2.4 藥敏試驗

選取含不同效果抗生素14種藥敏紙片進行藥敏擴散試驗。

3 結果

3.1 形態學觀察結果

在LB固體培養基上形成大小不一、扁平、表面粗糙、灰綠色的菌落，血瓊脂培養基中出現溶血環，粘稠，有特殊氣味；革蘭氏染色后顯微鏡下觀察該菌株是革蘭氏陰性桿菌，基本呈單個散在分布，部分成對出現。

3.2 生化結果

該菌株分解葡萄糖、木糖、果糖產酸，利用枸櫞酸鹽，硝酸鹽還原產氮氣，氧化酶試驗、明膠液化試驗、尿素水解試驗為陽性，硫化氫試驗、V-P試驗和吲哚試驗均為陰性。

3.3 分子生物學結果

根據16s rDNA測序、GenBank數據庫比對，該菌株與銅綠假單胞菌菌株SQ-5同源性達到97%。

3.4 藥敏試驗結果

對慶大霉素、頭孢呋辛、頭孢噻吩、多粘菌素B敏感，對痢特靈、四環素、紅霉素、青霉素、氯霉素、苯唑青霉素、先鋒霉素V、鏈霉素、壯觀霉素、諾氟沙星耐藥。

4 討論

綠膿桿菌是一種人畜共患條件性致病菌，該菌致病力較低但抗藥性強，廣泛分布于環境、土壤等自然界中，動物腸道內和皮膚上也可分離出，可致多種動物感染，臟器腫大，常與葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌造成混合感染。不同動物感染綠膿桿菌所表現的病癥有差異，狐貍感染綠膿桿菌可能導致流產、子宮化膿；羊感染綠膿桿菌可導致慢性化膿性肺炎，母羊導致流產；水貂導致出血性肺炎等疾病；牛感染綠膿桿菌多見臨床表現為肺炎或腹瀉。

隨著養殖業的規模化發展，抗生素作為飼料添加劑用來預防和控制畜禽的細菌性疾病已經成為主要措施，然而抗生素的不合理使用和濫用導致了動物源耐藥細菌大量出現，抗生素曾是治療細菌感染的有效藥物，然而現在因大量使用抗生素，導致許多細菌對抗生素產生耐藥性，已無法達到理想的治療效果，本試驗分離出的綠膿桿菌菌株也具有較高的耐藥性，在14種藥敏紙片的作用下，僅對氨基糖苷類抗生素慶大霉素、頭孢菌素類頭孢呋辛、頭孢噻吩、多肽類抗生素多粘菌素B敏感。如今細菌耐藥性逐漸增強，我們應當控制抗生素的使用，避免濫用抗生素出現耐藥菌株。

關于綠膿桿菌感染的治療，慶大霉素、頭孢呋辛、頭孢噻吩、多粘菌素B可作為治療綠膿桿菌的首選藥物。根據Septama Abdi Wira等人研究報告顯示，青蒿素與四環素聯合用藥對綠膿桿菌有很好的效果，因此也可以從聯合用藥等方式研究討論綠膿桿菌的治療方法。

5 結論

通過本試驗對病原菌進行形態學觀察、生化分析、16s rDNA測序等方法，確定其為綠膿桿菌，本例牛源綠膿桿菌與銅綠假單胞菌菌株SQ-5同源性極高。