蛋白質力學穩定性的測定方法在食品領域的研究進展

吳琪，儀淑敏*，李學鵬，謝晶，季廣仁，勵建榮

1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心（錦州 121013）；2.上海海洋大學食品學院（上海 201306）；3.錦州筆架山食品有限公司（錦州 121000）

隨著現代檢測技術的蓬勃發展，越來越多的測定方法被應用于食品工業。食品中蛋白質力學穩定性的測定方法有多種，該文主要介紹了熱分析技術、單分子技術、流變技術、質構分析。

熱分析技術可以測定蛋白質構象變化的熱效應，得到蛋白質折疊或解折疊過程中的熱力學參數，可以定量測定熱誘導產生的蛋白質分子內作用力的變化[1]。研究蛋白質熱力學穩定性主要采用差示掃描量熱法和等溫滴定量熱法測得熱力學參數，二者最大的區別在于差示掃描量熱法的升溫程序可以檢測蛋白熱膠凝化過程熱焓的變化，而等溫滴定量熱法只能在恒溫下測定蛋白凝膠的反應熱。熱力學參數的測定能獲得提高食品熱穩定性的最大限度，為評估食品穩定性和優化產品加工保藏工藝提供判定依據。

單分子技術是基于單分子層面上的操作，原子力顯微鏡力譜技術和熒光共振能量轉移技術均能用于表征蛋白質分子內的構象變化[2]。

流變技術分析了蛋白質的黏彈特性，在熱剪切的作用下，表征剪切速率與黏度的關系[3]。常見的流變學技術方法包括了流變儀分析法和微流變分析儀法。兩者有所不同，流變技術是對蛋白溶液進行熱剪切得到應力-應變關系，而微流變技術用布朗熱運動和粒子運動面積表征應力和應變。

質構分析測定了蛋白凝膠強度，反映的是與蛋白質力學特性有關的食品質地特性。

該文綜述了食品中蛋白質力學穩定性的測定方法，以期為評估食品質量提供參數依據，為優化食品產品設計提供技術參考。

1 熱分析技術

1.1 差示掃描量熱法

差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）是一種高靈敏度的非擾動技術，用于研究熱誘導相變的熱力學性質，并得到蛋白質折疊或解折疊過程中的熱力學參數，包括起始溫度（Tonset）、熔融轉變溫度（Tm）、量熱焓（ΔHcal）、復性指數（RI）[4]。Tonset是熱誘導蛋白質解折疊的起始溫度，Tm是轉變最大值，ΔHcal是DSC曲線中的面積，Tm和Tonset值越高蛋白質穩定性越好[5]。DSC測量了溶液溫度升高所需的能量，從而提供有關熱誘導蛋白質解折疊過程中結構變化的信息[6]。

蛋白質的DSC峰表明不同的蛋白質結構域在不同的溫度下展開，用差示掃描量熱儀測定豬肉肌原纖維蛋白-明膠混合物熱變性溫度，豬肉肌原纖維蛋白在57.22 ℃和68.64 ℃出現兩個明顯的吸熱峰，分別為肌球蛋白和肌動蛋白的熱變性溫度，明膠的加入使肌球蛋白的變性溫度降低[7]。近期研究中，研究了冷等離子體（CAP）對阿拉斯加鱈魚肌原纖維蛋白變性溫度的影響，使用差示掃描量熱儀測定肌原纖維蛋白的變性溫度，高壓下經CAP處理后肌原纖維蛋白的變性溫度顯著升高，熱穩定性提高，而低壓會破壞肌原纖維蛋白的穩定性，導致分子間作用力減弱和肌原纖維蛋白聚集[8]。

1.2 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）是直接檢測兩種溶液相互作用過程的熱效應，獲得分子相互作用過程中的結合常數（Kd）、結合計量比（N）、焓變（ΔH）、熵變（ΔS）等熱力學參數的一種實驗方法[9]，其中Kd和N乘積越小，相互作用越弱，需要加大反應物濃度[10]。根據熱力學參數計算出吉布斯自由能ΔG=ΔH-TΔS（ΔH＞0反應吸熱，ΔH＜0反應放熱），T是絕對溫度[11]。

1999年，Michael等[12]提出了ITC可用于定量測量蛋白質間相互作用的熱力學性質，通過確定配體與其結合伴侶締合時產生的熱量直接測量結合平衡。隨后，基于等溫滴定量熱法進行熱力學分析，有學者研究了有序單體蛋白質與內在無序蛋白質（IDP）在折疊中的相互作用，ITC測量的等溫線顯示了室溫附近的焓從吸熱轉變為放熱，表明了單體蛋白質與IDP結合產生了疏水效應[13]。采用ITC測得T=298 K，pH 7.4條件下比辛和乳清蛋白之間的結合能，將比辛滴定到乳清中得到吸附等溫線，ΔH的值為負，而ΔS的值為正，表明熵和焓有助于結合過程，由ΔG=ΔH-TΔS得出ΔG＜0，表明比辛與乳清蛋白的結合具有自發性，疏水作用起主要作用[14]。

2 單分子技術

2.1 原子力顯微鏡力譜技術

原子力顯微鏡力譜技術（atomic force microscope single molecule force，AFM-SMF）可以對單個蛋白質分子進行拉伸和松弛，還可以對具有代表性的單蛋白進行機械展開，直接表征蛋白單體特定的折疊和復性[15]。

1986年，原子力顯微鏡（AFM）被發明，并開始應用于在原子尺度上觀察非均勻生物樣品的形態和結構[16]。近年來，在傳統的AFM基礎上結合了單分子力譜技術（SMF），通過持續測量蛋白質中高能構象提供了有關蛋白質折疊途徑、動力學特性、相互作用和錯誤折疊的豐富信息[17]。迄今為止，AFM-SMF在理解糖、DNA和蛋白質的力學性質和力誘導結構重排方面取得了許多突破[18]。

根據力譜測量的定量特性確定打開蛋白質結構域和破壞單個受體或配體鍵所需力的值，從而在單分子層面得到蛋白質力學性質和結構的關系[19]。原子力顯微鏡用于蛋白質聚集的單分子表征，在蛋白質聚集初期，溶液中主要存在蛋白單體和寡聚體，AFM成像能夠顯示蛋白質聚集過程中存在的最小單體和寡聚體，并在納米尺度上測量其形貌[20]。原子力顯微鏡還可以用來研究用單個肽分子在底物上的去折疊過程，對單個肽分子進行拉伸，得到不連續的張力曲線，造成不連續性的原因是α-螺旋中部分氫鍵斷裂[21]。

2.2 單分子熒光共振能量轉移技術

單分子熒光共振能量轉移技術（single molecule fluorescence resonance energy transfer，SM-FRET）用于研究DNA、蛋白質等生物大分子的構象變化[22]。此技術是將單個蛋白分子上熒光供體和受體作為標記位點，定量測量供體和受體之間熒光光強及二者間的共振能量轉移效率，得到熒光光強隨時間變化的軌跡，再擬合出標記位點之間的距離，經統計學分析得到動力學數據[23]。

每種技術都有其自身的局限性，smFRET也不例外，smFRET的時間分辨極限大約是1 ms，因此，使用該技術探測蛋白質構象時，需要在毫秒級的時間分辨率上進行動力學測量[24]。1996年，單分子熒光共振能量轉移技術被發現，并用于研究兩個單分子間的相互作用[25]。1999年，首次使用smFRET測得單一蛋白能量傳遞效率（E＞0.9）[26]。目前smFRET已經被應用于許多不同蛋白質系統中蛋白質分子內構象變化的研究，例如，利用smFRET實現在脂質環境下對蛇形蛋白Ykt6的亞毫秒構象動力學測量，Ykt6與十二烷基磷酸膽堿（DPC）結合，形成穩定的復合物，Ykt6在其蛋白結構域與陷阱核的界面處發生了構象變化，說明脂質環境下蛋白質-脂質的相互作用[27]。

3 流變技術

3.1 流變儀分析法

流變測量分為動態測量和靜態測量，蛋白質的黏彈性采用動態測量測定儲能模量（G’）、損耗模量（G’’）和黏度（η），而靜態測量測定食品中蛋白質的蠕變和應力松弛，主要應用于食品加工領域[28]。

對添加天然淀粉和改性淀粉的肌原纖維蛋白（MP）進行溫度掃描動態流變試驗，淀粉-肌原纖維蛋白復合物溶膠在熱膠凝化過程中的彈性取決于G’，添加淀粉后MP凝膠的G’顯著增加，G’與淀粉的糊化溫度呈反比[29]。以肌原纖維蛋白（MP）和橄欖油為原料，在NaCl溶液中用MP或非肉蛋白預乳化，在pH 6.2下制備熱誘導復合凝膠，用流變儀研究不同的非肉蛋白（大豆分離蛋白、蛋清分離蛋白和酪蛋白酸鈉）預乳化液對MP凝膠流變性能的影響，結果為所有乳液組均顯著提高了MP凝膠的G’，表明非肉蛋白作為乳化劑修飾MP凝膠的潛力和粉碎肉制品的組織特性[30]。

3.2 微流變分析儀法

與傳統流變學方法相比，微流變學方法的優點是不存在干擾表面效應[31]。微流變分析儀基于擴散波光譜學（DWS）技術測量顆粒位移進而分析流體的黏彈特性，通過監測蛋白質分子的均方位移（MSD）實現在無干擾、無破壞的情況下對蛋白質凝膠的測量，從而從微觀結構的角度對蛋白質凝膠的黏彈特性進行定量分析[32]。這項技術使用多散斑擴散光譜（MSDWS）檢測出散斑圖像，并繪制去相關時間tdec-MSD曲線，去相關時間（tdec）是測量時間，并用廣義斯托克斯-愛因斯坦擴散關系計算存儲模量（G’）和損耗模量（G’’）[33]。

使用示蹤粒子和動態光散射技術來監測嵌入蛋白質溶液中的示蹤粒子的布朗運動，可以獲得樣品的零剪切黏度[34]。將粒子示蹤微流變學與宏觀流變學方法相結合，研究大豆分離蛋白（SPI）溶液及其穩定的乳液酸化過程流變性質的變化，SPI溶液經歷了溶液（G’’＞G’）-凝膠（G’＞G’’）-解凝（G’’＞G’）的過程，MSD先增大后減小，結果說明了SPI溶液在酸化過程中，蛋白質產生聚集，后期未完全解聚[35]。

4 質構分析

質構分析（texture Profile Analysis，TPA）模擬測定食品物料單次或多次咀嚼過程中的感官參數，測試結果反映的是食品質構特性，包括硬度、脆性、黏性、內聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性、回復性等[36]。

蛋白凝膠質構特性與肉制品的感官特性、理化性質和加工特性密切相關。硬度和彈性是衡量質構特性的兩個重要的力學指標，直接影響肉制品的質量。經超細粉碎處理，雞胸肉肌纖維蛋白膠凝硬度顯著增加，彈性提高，具有更好的凝膠性能[37]。質構分析可以設計具有特定質地特性的食品結構，以便尋求更多的替代性蛋白質來源。在酪蛋白調整乳清蛋白凝膠結構特性的研究中，酪蛋白的加入改善了乳清蛋白凝膠結構，使其黏聚性增強，硬度和斷裂度降低，保水性得以保持[38]。質構分析還可以評估加工過程中蛋白質的氧化損傷。使用質構儀測定即食雞肉餅在烹調、冷藏、微波加熱過程中的硬度，結論是烤制后的雞肉餅先冷凍再加熱硬度顯著下降，表明了肉類蛋白質的氧化損傷在很大程度上影響了經過嚴格加工的肉類產品的蛋白質質量、營養價值和質地特性[39]。

5 結語與展望

在食品領域中，蛋白質力學穩定性的測定有助于探究其物理性質，并通過定性測量和定量分析得到可靠的數據依據。蛋白質力學穩定性的測定方法可以有效地判定外界環境變化對蛋白質分子內作用力的影響，以及施加外力時蛋白質分子間的作用力變化。但這些測定蛋白質力學穩定性的技術存在著局限性，同一個技術指標采用不同研究手段會存在差異，需要多種技術的聯用得到更全面、更準確的力學指標。