原發性肝癌治療中索拉非尼耐藥發生機制的研究進展

陳華蕾，李威

中國原發性肝癌的發病率和病死率較高，發病數約占全球的46.71%，粗死亡率是全球的2.54倍[1]。2020年版《中國臨床腫瘤學會（CSCO）原發性肝癌診療指南》為中晚期原發性肝癌患者推薦了多種全身治療方案，其中靶向藥物占據重要地位。索拉非尼的出現，開辟了肝癌靶向治療的新時代。

索拉非尼是一種多激酶抑制劑，主要的作用靶點是酪氨酸激酶受體Flt-3、RET、血小板源性生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）α和β、血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）-1、-2和-3以及c-Kit等，發揮促進腫瘤細胞凋亡以及抑制血管生成和腫瘤細胞增殖的作用。然而，索拉非尼的客觀緩解率較低，只能將生存期延長至數月，并且僅有30%的患者治療有效，而且通常在6個月內出現耐藥[2]。研究表明，索拉非尼的耐藥機制包括表觀遺傳學改變、腫瘤微環境的缺氧、上皮-間質轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）、腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）活化、細胞凋亡、細胞周期失調和自噬等[3]。本文對原發性肝癌治療中索拉非尼耐藥發生機制的研究進展進行綜述。

1 索拉非尼耐藥產生的表觀遺傳學機制

表觀遺傳學修飾改變基因表達狀態，對腫瘤細胞的形成和調節腫瘤細胞的增殖和分化均有重要作用。本文探討非編碼RNA和甲基化修飾與索拉非尼耐藥的關系。

1.1 非編碼RNA與索拉非尼耐藥

非編碼RNA主要包括miRNA、lncRNA、cirRNA、piRNA、snoRNA和snRNA等，非編碼RNA不能轉錄形成蛋白質[4]，但可以調節細胞周期以及控制細胞的生長、發育、增殖和凋亡。部分非編碼RNA還可以作為評估腫瘤患者預后的生物學標志物，與腫瘤的侵襲、轉移和耐藥有關[5]。目前，在眾多的非編碼RNA中，miRNA和lncRNA在索拉非尼耐藥機制中扮演著十分重要的角色；近年來，cirRNA也漸受關注；而其他類型的非編碼RNA與索拉非尼耐藥的關系，尚未得到充分的驗證。

1.1.1 miRNA

miRNA是由19～25個核苷酸組成的內源性小單鏈RNA，可以通過干擾原癌基因和抑癌基因的表達而導致腫瘤的發生[6-7]。miRNA參與原發性肝癌耐藥的形成。

索拉非尼是中晚期原發性肝癌的標準治療藥物之一，其耐藥對肝癌治療具有重要意義[3]。部分miRNA的表達可以增加原發性肝癌對索拉非尼的耐藥性，這主要與影響腫瘤細胞原癌基因或抑癌基因的表達，并且調節相關信號轉導通路有關。其中，抑制抑癌基因PTEN的表達以及激活其下游PI3K/Akt信號通路較為常見。PI3K/Akt與Raf/MAPK/ERK是原發性肝癌發生中的關鍵性信號通路，2者之間通過共同的信號分子相互作用。索拉非尼主要抑制Raf/MAPK/ERK的激活，但miRNA介導的PI3K/Akt激活可以降低索拉非尼的療效。miRNA-216a、217、494、622、21和552等可以通過上述機制參與索拉非尼耐藥的形成[8-13]。mTOR通路的激活也與索拉非尼耐藥有關。mTOR是Akt的下游分子，miR-21和miR-494可以激活Akt/mTOR/LC3和Beclin 1通路，進而影響腫瘤環境中自噬介導的索拉非尼耐藥[10,13]。其他與索拉非尼耐藥相關的信號通路還包括miR-216a/217上調癌基因SMAD7的表達，進而激活轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路[9]，miR-622激活RAF/ERK通路[11]、miR-181a抑制其下游信號通路RASSF1/MST2/PUMA[14]以及miR-126-3p通過下調SPRED進而激活ERK及其下游分子[15]等。一些腫瘤相關蛋白可以通過促進腫瘤細胞增殖和抑制腫瘤細胞凋亡以降低索拉非尼的敏感性，如miR-221下調細胞凋亡分子caspase-3的表達而抑制腫瘤細胞凋亡[16]，miR-223則可通過抑制FBW7使c-Jun、c-Myc和Notch-1蛋白表達增加，從而促進腫瘤細胞增殖[17]。近年來的研究發現，糖代謝異常參與索拉非尼耐藥形成，miRNA可以作為該過程的中間橋梁。miR-21可使糖原合酶激酶3β磷酸化，進而抑制凋亡蛋白S6K與4EBP1結合而抑制腫瘤細胞凋亡[13]；miR-374上調可抑制hnRNPA1及其下游PKM2，減少糖酵解，引發索拉非尼耐藥[18]。

研究表明，索拉非尼耐藥還與部分miRNA下調有關。其中，miR-122備受關注。長期使用索拉非尼可使原發性肝癌細胞的miR-122表達下調，miR-122與胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor receptor type 1，IGF1R）表達呈負相關，IGF1R是腫瘤細胞的重要信號分子之一，在腫瘤的發生、抗腫瘤細胞凋亡以及抗腫瘤藥物耐藥中發揮重要作用。Akt是IGF1R關鍵的下游效應物，IGF1R活化可以進一步激活PI3K/Akt信號通路和Ras/Raf/MAPK通路，降低原發性肝癌細胞對索拉非尼的敏感性和治療效應[19]。除此之外，miR-122下調所致的SerpinB3過表達，可使原發性肝癌對索拉非尼更具抗性[20]。miR-130-5p和miR-375表達下降可以分別激活CLCF1介導的PI3K/Akt通路以及索拉非尼-ASH1/miR-375/PDGFC通路以降低索拉非尼的效應[21-22]。低水平miRNA還可以通過調節腫瘤細胞相關蛋白降低索拉非尼的敏感性，如miR-27b和miR-193b作為細胞凋亡調節因子，分別沉默p53和（或）髓樣白血病細胞分化蛋白基因以增強原發性肝癌細胞對索拉非尼的敏感性，因此低水平miR-27b和miR-193b可能會降低索拉非尼的效應[3]。血清外泌體中的miRNA-744可以增加PAX2的表達，參與腫瘤細胞增殖和索拉非尼耐藥[23]，而miR-140-3p與miRNA-744的作用機制相似[24]。還有研究表明，一些miRNA的高表達可以增加索拉非尼的敏感性，如miR-541、miR-486-3p、miR-23b-3p和miR-194等，這些miRNA均有望為解決索拉非尼的耐藥性提供新的靶點[25-28]。

針對索拉非尼耐藥的原發性肝癌，抑制耐藥相關上調的miRNA或阻斷其誘導的信號通路，可能會增加索拉非尼的效應。同樣地，外源性補充耐藥相關下調的miRNA，也可以增強索拉非尼治療的敏感性。上述2種治療思路已在細胞研究和動物實驗中得以證實。

目前關于miRNA與索拉非尼耐藥的機制研究，主要是通過采用生物信息技術和患者的組織樣本，找出可能相關的miRNA，并將其應用于細胞研究和動物實驗，而尚未發現相關的臨床研究。即便如此，大量的基礎研究為后續的臨床研究奠定了基礎，以miRNA為靶點，克服索拉非尼耐藥性的研究有望為原發性肝癌的治療策略提供新的方向。

1.1.2 lncRNA

通過對腫瘤基因組圖譜和數據庫進行分析以及對病理組織標本進行檢測，探討lncRNA在原發性肝癌索拉非尼耐藥中的作用。lncRNA長度超過200個核苷酸，可以與miRNA相互作用，調節相關信號轉導通路，共同參與索拉非尼的耐藥性。lncRNA SNHG1通過SLC3A2激活Akt信號通路，使其作用于下游的GSK-3β和mTOR，誘導腫瘤細胞增殖及抑制其凋亡，參與索拉非尼耐藥性的形成[29]。在原發性肝癌中，lncRNA SNHG3可以調節miRNA-128/CD151途徑，激活PI3K/Akt信號通路，進而誘導EMT和索拉非尼耐藥性的形成[30]。對原發性肝癌患者的組織標本進行檢測，發現腫瘤組織中DANCR過表達，并且與原發性肝癌患者的預后相關。相關細胞研究的結果顯示，lncRNA DANCR可以激活原發性肝癌細胞中IL-6/STAT3通路而參與耐藥的形成[31]。FOXD2-AS1在索拉非尼耐藥的原發性肝癌細胞中的表達下降，進而促進miR-150-5p降 解TMEM9 mRNA，OXD2-AS1和TMEM9表達下調與索拉非尼耐藥性呈正相關，因此lncRNA FOXD2-AS1通過FOXD2-AS1/miRNA-150-5p/TMEM9/Nrf2信號通路參與耐藥[32]。目前，對lncRNA NEAT1的研究頗受關注。一方面，lncRNA NEAT1表達上調可以抑制miR-204表達水平，進而促進ATG3的表達，增強原發性肝癌細胞自噬，影響索拉非尼的療效；另一方面，lncRNA NEAT1可使miR-335表達下調，并且介導c-Met-Akt通路激活，降低原發性肝癌對索拉非尼的敏感性[33-34]。除lncRNA通過miRNA調節信號轉導以外，lncRNA H19和lncRNA TTN-AS1等可以通過影響原發性肝癌的上皮間質轉化和細胞周期而參與耐藥性的形成[35-36]。一些動物實驗通過對lncRNA進行基因敲除以增強索拉非尼的敏感性，但缺乏相關的臨床研究。以lncRNA為靶點克服索拉非尼的耐藥性是未來的重要研究方向之一。

1.1.3 circRNA

既往的索拉非尼耐藥研究主要聚焦于miRNA和lncRNA。最新的研究發現，在索拉非尼耐藥的原發性肝癌細胞中，circRNA表達發生顯著改變，并且差異表達的circRNA可能參與索拉非尼耐藥和腫瘤進展[37]。circRNA-SORE可與細胞質中的YBX1結合，阻止YBX1與E3泛素連接酶Prp19相互作用，抑制PRP19介導的YBX1降解，從而降低療效反應。此外，circRNA-SORE可以經由外泌體在原發性肝癌細胞之間傳播，使耐藥的原發性肝癌細胞的數量增加[38]。靶向circRNASORE或YBX1為克服索拉非尼耐藥奠定了基礎。此外，circRNA-SORE能夠隔離miRNA-103a-2-5p和miRNA-660-3p，從而競爭性激活Wnt/β-catenin途徑，并誘導耐藥。針對這一機制，circRNA有望成為原發性肝癌的新治療靶點[39]。目前，對cirRNA與索拉非尼耐藥的研究尚處于起步階段，還缺乏充足的基礎研究證據。

1.2 甲基化修飾與索拉非尼耐藥

異常甲基化可改變基因表達并誘導腫瘤發生。研究證實，MORC2-NF2/KIBRA軸是維持索拉非尼耐藥的關鍵環節。腫瘤細胞中的MORC2可以識別并結合NF2和KIBRA啟動子DNA上的甲基轉移酶DNMT3A，發生甲基化修飾，從而維持索拉非尼的耐藥性[40]。m6A可修飾調節mRNA的穩定性，并且參與剪接和翻譯。METTL3是主要的m6A甲基轉移酶，FOXO3是其重要的下游分子。腫瘤微環境中的m6A通過YTHDF1依賴機制增強FOXO3 mRNA 3’-非翻譯區的修飾穩定性，最終導致并維持索拉非尼的耐藥性[41]。m6A RNA甲基化還可以降低HNF3γ的表達，使肝癌細胞去分化，降低索拉非尼的療效。相關研究表明，原發性肝癌中METTL14依賴性m6A甲基化可以介導HNF3γ表達下降，HNF3γ在腫瘤分化和索拉非尼耐藥中發揮重要作用，其表達下調可使原發性肝癌細胞對索拉非尼的敏感性下降。因此，HNF3γ有望成為索拉非尼治療靶點和療效預測指標[42]。m6A修飾的circRNA-SORE可以通過調節β-catenin信號通路以維持索拉非尼的耐藥性[39]。由此看來，原發性肝癌相關基因的甲基化水平可以影響索拉非尼的療效，應進一步開展相應的基礎研究和臨床試驗。

2 索拉非尼耐藥的藥物運輸機制

索拉非尼在腫瘤細胞之間的運輸會影響其抗腫瘤效應。腫瘤細胞之間主要通過ATP結合盒轉運蛋白和外泌體囊泡實現藥物運輸。

2.1 ATP結合盒轉運蛋白

ATP結合盒轉運蛋白屬于膜內在蛋白質超家族，能夠水解ATP釋放能量，并且供各種分子實現跨膜轉運，將藥物從腫瘤細胞中排出，從而減弱藥物的療效[43]。索拉非尼等多種激酶抑制劑均可與ATP結合盒轉運蛋白相互作用。一些ATP結合盒轉運蛋白的拮抗劑可以為對抗索拉非尼耐藥開辟新的途徑[44]。研究證實，β-石竹烯氧化物可以抑制ATP結合盒轉運蛋白，并且改善原發性肝癌細胞對非毒性劑量索拉非尼的療效；此外，β-石竹烯氧化物還可以抑制索拉非尼的降解，促進藥物在腫瘤細胞內積聚，增強細胞毒性反應[45]。在HepG2/S原發性肝癌細胞中，索拉非尼的耐藥性還與CSN5基因有關。CSN5基因沉默可下調多種耐藥相關蛋白（ATP結合盒轉運蛋白B1、ATP結合盒轉運蛋白2和ATP結合盒轉運蛋白G2）的表達，進而增強索拉非尼的療效[46]。

2.2 外泌體囊泡

外泌體是包含復雜RNA和蛋白質的小膜泡，直徑為40～100 nm。外泌體有助于腫瘤細胞之間的信息傳遞，并且參與腫瘤細胞的侵襲和轉移，還是引發索拉非尼耐藥的重要環節[47-48]。來自原發性肝癌細胞的外泌體表達特異性標志物CD9和CD63可以通過激活HGF/c-Met/Akt信號通路，抑制索拉非尼誘導的細胞凋亡，進而使腫瘤細胞對索拉非尼產生耐藥性[49]。研究顯示，siGRP78修飾的外泌體靶向原發性肝癌細胞中的GRP78，進而抑制原發性肝癌細胞的生長和侵襲，逆轉荷瘤小鼠對索拉非尼的耐藥性[50]。動物實驗表明，使用腫瘤細胞的外泌體（DC-TEX）對樹突狀細胞進行脈沖處理，并將其與索拉非尼和程序性死亡受體1（programmed cell death proten-1，PD-1）抑制劑聯用，能夠增強索拉非尼在原發性肝癌模型中的療效[51]。目前，研究人員已嘗試將外泌體作為治療靶點，其中包括使用外泌體負載治療藥物，如功能蛋白、lncRNA和化療藥物等，為提高索拉非尼的敏感性提供新的方向。

3 腫瘤微環境與索拉非尼耐藥性的產生

腫瘤微環境是指腫瘤的發生、生長及轉移的環境，主要由腫瘤細胞和非腫瘤細胞（腫瘤相關免疫細胞如巨噬細胞、骨髓源抑制細胞、腫瘤相關中性粒細胞、癌癥相關成纖維細胞和調節性T細胞）構成。在腫瘤微環境中，腫瘤基質和腫瘤細胞可產生炎癥因子（如生長因子、細胞因子和趨化因子）參與腫瘤相關免疫抑制作用，幫助腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移。腫瘤微環境與索拉非尼耐藥性的形成有一定關聯，以下將進行展開說明[52]。

3.1 缺氧

在原發性肝癌的發生和發展過程中，缺氧通過激活缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）和VEGF以促進腫瘤血管生成，索拉非尼的抗血管生成作用源于阻斷HIF/VEGF途徑[53-54]。持續使用索拉非尼可以上調HIF-1α或HIF-2α的表達，促進線粒體吞噬、細胞增殖、葡萄糖代謝、血管生成、腫瘤侵襲和轉移等基因的轉錄，并且激活相應的信號轉導通路，如HIF-1α介導的糖代謝和細胞自噬等途徑以及NF-κb通路；HIF-2α介導的TGF-α/EGFR和pSTAT3/pAKT/pERK途徑，可引發索拉非尼耐藥。此外，耐受缺氧和營養不足的腫瘤細胞的存活和積累限制了索拉非尼的療效[55]。目前，可以通過抑制HIF及其相關信號轉導通路以克服索拉非尼的耐藥性，如抑制COX/PGE2軸以調節HIF-2α的表達[56]，或使用二甲雙胍調節HIF-2α和TIP30的表達以增強原發性肝癌細胞對索拉非尼的敏感性[57]。ADRB2對維持肝癌細胞的增殖和存活十分重要，ADRB2信號通路可負性調控細胞自噬，進而使HIF-1α穩定性增加，并且通過調節肝癌細胞的葡萄糖代謝等，從而促進索拉非尼耐藥[58]。

3.2 免疫因素

免疫逃逸在腫瘤的發生、發展和耐藥中的作用日益受到關注，為腫瘤治療提供了新的方向。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）通過表達細胞因子和趨化因子以抑制抗腫瘤免疫，促進腫瘤進展[59]。動物研究發現，持續使用索拉非尼可導致腫瘤微環境中TAM數量增加[60]。索拉非尼耐藥的原發性肝癌患者體內的M2型TAM數量顯著增加。M2型TAM可以分泌肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），通過激活腫瘤細胞中的HGF/c-Met、ERK1/2/MAPK和PI3K/AKT通路以維持腫瘤細胞的生長和轉移，并且增強索拉非尼的耐藥性。除此之外，HGF對周圍的巨噬細胞具有趨化作用，并且通過反饋作用增強索拉非尼的耐藥性[61]。

腫瘤相關炎癥反應是近年來的研究熱點之一。腫瘤微環境中的腫瘤相關中性粒細胞（tumorassociated neutrophil，TAN）可以通過分泌促炎因子和血管生成因子以及免疫調節等，促進腫瘤的發生和發展[62]。TAN分泌的CCL2和CCL17是影響腫瘤進展和預后的重要因素。一方面，CCL2可以募集巨噬細胞浸潤腫瘤組織；另一方面，CCL17對Treg細胞具有誘導募集作用。TAN介導的腫瘤巨噬細胞和Treg細胞的募集可以刺激新生血管形成，從而促進原發性肝癌的生長和轉移，對索拉非尼產生耐藥性。因此，TAN的浸潤程度可以作為預測原發性肝癌對索拉非尼效應的生物學標志物，而耗竭TAN可以增強索拉非尼的療效[63]。

除此之外，索拉非尼可以通過影響Akt和ERK1/2磷酸化，抑制自然殺傷細胞的增殖和反應性，減弱自然殺傷細胞的抗腫瘤效應，參與索拉非尼耐藥的形成[64]。SHI等[51]發現，索拉非尼治療的原發性肝癌小鼠的腫瘤組織中，Treg細胞的數量和程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表達上調。樹突狀細胞可使CD8+T細胞數量增多，并且減少Terg細胞的數量。PD-1抗體可以在不改變Treg細胞數量的基礎上恢復CD8+T細胞的數量。根據既往研究的結果，外泌體可以作為治療藥物的載體（如功能蛋白、ncRNA以及化療藥物等），改善原發性肝癌治療過程中的耐藥性，因此樹突狀細胞與外泌體聯合PD-1抑制劑有望增強索拉非尼的療效[51]。免疫微環境是腫瘤發生和治療的研究熱點，需要開展更多研究以探索單藥治療或聯合治療提高索拉非尼治療敏感性的方式。

4 病毒感染與索拉非尼耐藥性

乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染是中國原發性肝癌發生的主要原因。研究表明，肝炎病毒感染與索拉非尼耐藥性有關。乙型肝炎病毒X基因編碼的X蛋白是一種多功能蛋白，主要調節病毒的復制，顯著影響肝細胞的信號傳導、新陳代謝、凋亡、細胞因子的產生、細胞周期的調控以及癌基因和抑癌基因的表達，干擾線粒體氧化磷酸化等能量代謝過程，導致細胞氧化損傷，促進細胞凋亡。乙型肝炎病毒的DNA可以隨機整合入宿主基因，尤其是乙型肝炎病毒X蛋白C末端，促進肝癌發生的同時，抑制凋亡級聯反應如STAT3/Nanog通路，使原發性肝癌細胞對索拉非尼產生抗藥性[65]。研究發現，PMAPK14（與索拉非尼耐藥相關的一種蛋白激酶）磷酸化與乙型肝炎病毒X蛋白表達相關，抑制pMAPK14的表達可以增強索拉非尼的療效，改善HBV相關原發性肝癌患者對索拉非尼的耐藥性，因此，pMAPK抑制劑聯合索拉非尼有望提高HBV相關原發性肝癌對索拉非尼的敏感性[66]。WU等[67]發現，乙型肝炎病毒相關原發性肝癌中，HNF4α表達明顯下降，并且與miRNA-122啟動子的結合減弱，由此抑制miRNA-122基因的表達，上調GALNT10（與miRNA-122表達呈負相關）的表達，進而誘導索拉非尼耐藥性的產生，因此調節miRNA的表達有望成為增強乙型肝炎病毒相關原發性肝癌對索拉非尼反應的潛在方法。目前，病毒感染與索拉非尼耐藥性的關系尚未闡明，今后需要在確保安全性和有效性的基礎上，開展相關的臨床研究。

5 其他機制

自噬是真核生物中細胞內物質周轉的重要過程，不僅參與腫瘤的發生和發展，同時是在治療和代謝應激的情況下，原發性肝癌對索拉非尼等抗血管生成藥物產生耐藥性的重要機制[68]。因此，如何通過改變自噬水平來控制索拉非尼耐藥性的產生以及提高索拉非尼的療效，已成為關注的焦點之一。鐵死亡是一種非凋亡性調節性細胞死亡過程，主要由鐵離子或鐵酶催化的細胞中脂質氧化物的代謝異常所致。鐵死亡產生過量的脂質過氧化產物，發生氧化應激，從而引發細胞死亡。索拉非尼可誘導鐵死亡的發生，從而導致耐藥性的形成[69]。除此之外，最近的研究表明，腫瘤干細胞也與原發性肝癌的索拉非尼耐藥有關，PTK2活化Wnt/β-catenin信號轉導，進而激活腫瘤干細胞的特性是其可能的作用機制[70]。

6 討論

索拉非尼是晚期原發性肝癌常用的全身治療藥物，但其耐藥性限制了療效。目前，臨床上除改用其他一線或二線治療以外，可以通過聯合細胞毒藥物以及其他靶向藥物以提高敏感性。近年來，免疫治療的出現為原發性肝癌的治療提供了新的方向。免疫檢查點抑制劑聯合靶向治療成為潛在的治療手段。

當前針對索拉非尼的耐藥機制應開展進一步的研究，綜合生物信息技術、組織病理學檢查、細胞實驗和動物實驗等，從分子生物學、藥物運輸以及病毒感染等多個領域，探索新的治療靶點，以提高原發性肝癌對索拉非尼的敏感性。