膠原蛋白的制備、生物學特性及應用

厲盈穎，張俊杰，吳志明，馬德蓉

江蘇海洋大學食品科學與工程學院（連云港 222000）

膠原蛋白是動物體內(nèi)非常重要的一類功能性蛋白質(zhì)，在動物體內(nèi)含量最多、分布也最廣，可占蛋白總量的25%～30%[1]。作為一種結締組織蛋白，膠原在動物的皮膚、軟骨、跟腱、韌帶等眾多的組織和器官中均有分布，目前市場上所應用的各種膠原類產(chǎn)品，也大都是通過動物組織來提取加工得到的。長期以來，牛、豬等陸生動物一直都是膠原蛋白的主要提取來源，但由于瘋牛病、豬流感、口蹄疫等各種牲畜傳染病的爆發(fā)，以及一些地區(qū)的宗教文化影響，人們也在不斷尋求膠原蛋白的其他獲取途徑[2]。

與明膠以及膠原蛋白肽類物質(zhì)相比，從動物組織中提取的膠原蛋白，具有典型的膠原三股螺旋結構，是擁有完整四級結構的生物大分子，這也是膠原蛋白區(qū)別于明膠以及膠原蛋白肽類物質(zhì)最重要的特點。特殊的結構賦予了膠原蛋白優(yōu)良的生物相容性、止血性、可降解性等生物特性，同時還能與組織及細胞間產(chǎn)生良好的相互作用，具有促進細胞的增殖分化以及傷口愈合等功能。作為一種優(yōu)質(zhì)的天然高分子生物材料，膠原蛋白在生物醫(yī)學材料領域也是得到了越來越多的研究與應用。

1 膠原蛋白的制備

1.1 原材料的選擇

膠原蛋白根據(jù)其基因編碼組合的不同可以分為許多類型，目前已發(fā)現(xiàn)了28種膠原蛋白的類型[3]。不同類型的膠原蛋白在動物體內(nèi)分布各異，其含量也有很大差別。Ⅰ型膠原蛋白分布最廣，可以從皮、腱、筋、骨等眾多組織中提取；Ⅱ型膠原蛋白主要由軟骨組織提取，一般都以豬、牛、羊等動物的軟骨組織作為提取材料；Ⅲ型膠原蛋白可以從胚胎真皮、心血管等組織中提取；Ⅳ型膠原蛋白是基底膜的主要成分，可以從富含基膜的組織中提取，例如晶狀體囊、角膜后彈性膜等；Ⅴ型膠原蛋白可以從角膜、胚胎絨毛膜、胎盤等組織中提取。此外還有許多其他類型的膠原蛋白，廣泛分布在不同的機體、不同的組織內(nèi)，可以通過適當?shù)墓に噥硖崛　⒓兓瑫r也有部分膠原蛋白尚處于研究階段，迄今為止還未探究出完整的制備方法[4]。

1.2 膠原蛋白的提取工藝

膠原蛋白的提取方法有許多，例如酸提法、酶提法、中性鹽提取法、堿提法等，根據(jù)不同的膠原蛋白可以選擇不同的提取方式，但其基本的原理都是通過改變蛋白質(zhì)的環(huán)境條件來使膠原蛋白從其他蛋白質(zhì)中分離[5]。中性鹽提取法應用的較少，它適用于組織中新合成的膠原，這部分膠原交聯(lián)程度較低，可溶性高，通常采用0.15～1 mol/L NaCl溶液提取。堿提法是將組織原料在堿性溶液中浸泡提取膠原蛋白，而堿性的條件容易使膠原蛋白變性，產(chǎn)生消旋現(xiàn)象，從而影響膠原蛋白結構[1]。

目前酸提法和酶提法是膠原蛋白提取工藝中最常用的方法，因為組織中絕大部分膠原交聯(lián)程度高，需要在酸性條件或酶處理后才能溶解。其中，酶提法由于其反應速度快、提取率高，所得膠原蛋白純度高、性質(zhì)好，目前也是用作生物材料的膠原蛋白最常用的提取方式。Duan等[6]用乙酸浸提黑魚皮，得到膠原粗提液，并通過鹽析、復溶、凍干等步驟得到了酸溶膠原蛋白，將酸提后的不溶物用含胃蛋白酶的乙酸按上述方法處理，得到酶溶膠原蛋白，兩種方式均在4 ℃條件下進行，得到的膠原蛋白樣品保持了良好的三螺旋結構。

1.3 膠原蛋白的分離純化

從組織中提取的膠原蛋白往往都容易摻雜一些雜質(zhì)，同時，從同一組織中也往往能提取出不同種類型的膠原蛋白，所以要想得到純度較高、或是某單一類型的膠原蛋白物質(zhì)，就必須通過分離純化來實現(xiàn)。常用的膠原蛋白純化方法有鹽析、透析、離子交換色譜、超濾等，目前實驗室中最常用的是鹽析-透析結合法，利用蛋白質(zhì)在高鹽條件下因溶解度降低而被析出的特點，將膠原蛋白從溶液中沉降出來，并通過透析的方式去除鹽溶液，進而得到純化的膠原蛋白[7]。李賽娜等[8]在牛軟骨Ⅱ型膠原提取液中加入了3 mol/L NaCl溶液，在22 ℃下鹽析32 h后，得到了純化的Ⅱ型膠原蛋白，回收率可達91%，樣品純度為92.2%。

2 膠原蛋白的生物學特性

2.1 低免疫原性

膠原蛋白的免疫原性很低，甚至在1954年以前，膠原蛋白被廣泛認為是不具備抗原性的[9]。盡管后來有研究表明膠原蛋白會與抗體相互作用，但其依舊是一種低抗原性蛋白質(zhì)。膠原蛋白的抗原決定簇有三類，第一類是膠原蛋白的完整三螺旋結構引起的；第二類是三螺旋結構中的氨基酸序列引起的；第三類是位于膠原蛋白非螺旋末端區(qū)的端肽引起的，其中端肽是引起膠原蛋白免疫原性的主要因素，在天然膠原和變性膠原中均存在。因此，在提取過程中，可以通過添加蛋白酶來去除端肽，以降低其免疫原性。然而，去除端肽后的膠原蛋白不便于交聯(lián)，因此，針對應用于組織工程領域的膠原蛋白，則需要保留其端肽，以獲得高強度的生物組織材料，這部分膠原蛋白可以通過戊二醛交聯(lián)等方式來降低其免疫原性[10]。

2.2 生物相容性

膠原蛋白是生物體結締組織中的重要成分，能與宿主細胞和組織之間產(chǎn)生良好的相互作用，具有誘導細胞增殖、分化等功能。膠原蛋白的特殊三螺旋結構為細胞外基質(zhì)構建了網(wǎng)絡支架，能對細胞起到錨定和支持的作用，為細胞提供了增殖分化的良好環(huán)境[11]。膠原蛋白可以促進不同種類細胞的生長，對細胞的分裂也具有一定作用，此外，膠原蛋白還能夠增加細胞的黏結，并對細胞的形態(tài)、運動等起到控制作用[1]。

2.3 可生物降解性

膠原蛋白是一種可生物降解的特殊物質(zhì)，在膠原酶的特異性作用下，膠原蛋白的肽鏈被切割，其三螺旋結構受到破壞，使得膠原蛋白被降解成各種片段。這些膠原片段會通過兩種方式發(fā)生進一步的降解，一種是在體溫條件下自發(fā)變性，變性的膠原蛋白片段在酶的作用下被降解成氨基酸或寡肽，從而被人體吸收利用或代謝排出；還有一種是通過細胞的吞噬作用，例如結締組織細胞和炎癥細胞等，都能將膠原片段吞噬，并通過溶酶體將這些片段進一步降解[12]。

2.4 止血性

膠原蛋白具有良好的止血作用，原因在于其能促進血小板凝集，形成血栓，從而達到止血的目的。血管受到損傷后，血小板會與血管內(nèi)皮下的纖維膠原直接接觸，血小板被激活，釋放出顆粒成分，從而促進凝血，達到止血的目的。利用這樣的特點，膠原蛋白可被有效運用于生物止血材料的制備，但在利用膠原蛋白制備心血管裝置時，則必須抑制膠原蛋白和血小板之間的作用，防止凝血，目前在制備膠原蛋白生物材料時，常采用戊二醛交聯(lián)或肝素化合物涂敷等方式，來防止膠原蛋白與血小板的作用[13]。

2.5 高機械強度

膠原蛋白是由三條左手螺旋的多肽鏈，相互纏繞形成右手超螺旋結構的高分子蛋白質(zhì)，這種特殊的三螺旋結構使膠原蛋白具有很高的機械強度，同時，膠原蛋白分子內(nèi)和分子間的各種次級鍵也對維持膠原蛋白的穩(wěn)定性起著非常重要的作用。利用這種特性，膠原蛋白可以在生物縫合線、敷料、以及組織工程器官的研制中發(fā)揮重大的效用。此外，膠原蛋白還可與交聯(lián)劑交聯(lián)來進一步提高其機械強度，可根據(jù)生物材料的制備需求，采用不同的交聯(lián)劑，使用不同的交聯(lián)方法，得到不同機械強度的膠原蛋白產(chǎn)品[14]。

3 膠原蛋白生物材料的應用

3.1 醫(yī)療器械領域

3.1.1 敷料

敷料是醫(yī)學領域非常常見的一種材料，具有治療傷口感染、防止體液流失、促進組織再生以及傷口閉合等作用[15]。敷料可分為傳統(tǒng)敷料、生物敷料、合成敷料以及復合敷料四類，其中生物敷料以其毒副作用小、與人體組織相容性良好、抗原性低、有良好的生理活性等優(yōu)點，逐漸成為醫(yī)用敷料中一種接近于理想要求的敷料。膠原蛋白目前也被廣泛應用于生物敷料的研制，膠原蛋白敷料能吸收大量組織滲出物，防止傷口干裂，促進凝血，利于表皮細胞的增殖修復，還可被生物體降解吸收，可用于治療不同病原的皮膚損傷[16]。

3.1.1.1 海綿敷料

膠原蛋白海綿是由膠原蛋白溶液制成的海綿狀固體制劑，可以有效地吸附血小板，促進創(chuàng)面凝血，還可用于各種組織器官的填充與修復，是膠原蛋白生物材料中非常重要的一種產(chǎn)品形式。Ueda等[17]采用熱交聯(lián)的方式，在膠原蛋白海綿中引入轉化生長因子TGF-β1，并將其應用于顱骨缺損的家兔中，6周后，顱骨缺損的部位被新形成的骨所覆蓋，其治療效果遠優(yōu)于空白組。Lewis等[18]將N-羥基琥珀酰亞胺官能化聚乙二醇（NHS-PEG）與膠原蛋白海綿結合制成止血敷料，用于凝血障礙患者。通過大量的臨床研究可知，NHS-PEG膠原蛋白海綿可以有效運用于創(chuàng)口止血，具有凝血速度快、止血效果好，不易產(chǎn)生血腫等優(yōu)良特點。

3.1.1.2 膜敷料

將膠原蛋白制成膜運用于燒傷等創(chuàng)傷，也是膠原蛋白用作敷料的一種形式，其制作工藝非常簡單，就是在膠原蛋白溶液中加入各類有效物質(zhì)，然后置于平皿內(nèi)加熱，使其蒸發(fā)成膜。膠原蛋白膜具有低抗原性、可滅菌性等優(yōu)良特性，能良好地緩解創(chuàng)面疼痛，且成本低，適用于供皮區(qū)和淺表皮層等干凈、干燥的傷口[19]。高智仁等[20]采用氨熏成膜法和鹽析法制備豬皮膠原蛋白膜，通過動物實驗發(fā)現(xiàn)采用膠原蛋白膜覆蓋的小鼠在創(chuàng)傷愈合程度上要明顯優(yōu)于對照組，可見膠原蛋白膜可以有效應用于表層創(chuàng)傷治療。臘蕾等[21]在膠原蛋白基質(zhì)中加入了吲哚美辛，在37 ℃加熱3 h后得到了乳白色半透明、光滑、具有彈性的膠原蛋白膜。由于吲哚美辛具有消炎、止痛的效用，所制備得到的復合型膠原蛋白燒傷膜能有效地促進傷口愈合、防止創(chuàng)面感染。

3.1.1.3 凝膠敷料

膠原蛋白凝膠的含水量很高，有良好的生物相容性和軟組織相似性。將膠原蛋白凝膠用于燒傷敷料，能在創(chuàng)面形成一層保護膜，防止創(chuàng)面受污染，且膠原蛋白具有許多生物性功能，更有利于創(chuàng)口皮膚組織的修復與愈合。膠原蛋白凝膠易與創(chuàng)面滲出液結合，不會出現(xiàn)積液、積膿的現(xiàn)象，可以有效避免對患者傷口的二次傷害，這也是凝膠敷料區(qū)別于其他敷料最突出的優(yōu)勢。高智仁等[22]將磺胺嘧啶銀與膠原蛋白凝膠結合制備得到復合凝膠敷料，通過臨床試驗，發(fā)現(xiàn)其對燒傷創(chuàng)面的治愈具有良好的效用，同時具備優(yōu)良的抗感染效果，可見膠原蛋白凝膠與抗菌藥物復合制備的創(chuàng)傷敷料可以更滿足臨床的需求。楊小紅等[23]在豬腱Ⅰ型膠原中加入西黃芪膠、甘油、氧氟沙星等，制備了Ⅰ型膠原蛋白復合凝膠敷料，將此敷料運用于褥瘡的治療，試驗結果顯示，使用復合凝膠敷料的Ⅱ°褥瘡病人均在2～3周內(nèi)愈合，Ⅲ°褥瘡病人在4周內(nèi)明顯好轉，其治愈效果與對照組相比，具有非常顯著的差別。

3.1.2 手術縫合線

手術縫合線在外科手術中起著至關重要的作用，手術切口、器官移植、創(chuàng)口止血等均需要運用手術縫合線。根據(jù)生物降解功能可以把手術縫合線分為不可吸收和可吸收縫合線兩種，前者無法被機體降解，容易產(chǎn)生組織反應，且需要通過后期拆線來從人體中移除，容易使創(chuàng)口留下傷疤，而可吸收縫合線能被生物體降解吸收，具有良好的生物相容性，既避免了對患者的二次傷害，也不會引起機體的排異反應。

由于膠原蛋白各種優(yōu)良的生物學性質(zhì)，將其運用于可吸收縫合線也是目前較為熱門的研究方向。膠原蛋白制成的縫合線生物相容性好、纖維結構強韌、具有良好的止血效果等優(yōu)點，一般采用濕法紡絲工藝來制備膠原蛋白縫合線，將原料配置成混合液，經(jīng)過濾、去泡等處理后，通過一定壓力壓入紡絲泵進行噴絲，而后進入凝固浴中成型，再經(jīng)交聯(lián)、干燥、收卷等一系列操作，最終得到膠原蛋白縫合線成品[24]。郭振友等[25]以牛膠原蛋白為原料制備得到的縫合線具有易打結、生物相容性好、無創(chuàng)口副作用等優(yōu)點，且其打結強度遠超于美國藥典標準，被廣泛應用于臨床。

3.2 組織工程領域

3.2.1 人工皮膚

早期大都是以膠原蛋白敷料作為人工皮膚來修復患者的各類創(chuàng)面，而隨著組織工程的出現(xiàn)，人工皮膚與膠原蛋白敷料的概念也就逐漸被區(qū)分。膠原蛋白在人工皮膚中的應用，是以膠原蛋白為基質(zhì)構建生物支架來為細胞提供生長環(huán)境，使得具有活性細胞的膠原蛋白人工皮膚能被運用于患者的各類創(chuàng)面，從而促進傷口的愈合。朱堂友等[26]在鼠尾I型膠原中加入了殼多糖、透明質(zhì)酸、肝素等物質(zhì)，得到了復合膠原蛋白凝膠，并將角質(zhì)形成細胞接種于凝膠上進行細胞培養(yǎng)，制成了含有活性細胞的膠原蛋白-殼多糖復合人工皮膚，有效提高了創(chuàng)面的抗菌能力，防止傷口感染。Kuroyanagi等[27]將成纖維細胞接種于膠原蛋白海綿，制備得到真皮替代物，將所制備的人工皮膚應用于145例不同的傷口，結果顯示，皮膚燒傷和深度皮膚燒傷的治愈率可達96%，創(chuàng)傷性皮膚缺損治愈率達91%，褥瘡和Ⅱ度創(chuàng)傷治愈率可達100%。

3.2.2 人工角膜

膠原蛋白由于其優(yōu)良的生物特性，對于角膜細胞的形態(tài)與生長起著非常重要的作用。膠原蛋白角膜可以保護并促進角膜創(chuàng)口的修復，且有利于釋放抗生素、抗菌藥物、抗青光眼藥物等多種有效物質(zhì)[11]。趙世紅等[28]以豬鞏膜為原料制備得到干態(tài)膠原蛋白角膜，并通過浸泡的方式引入藥物分子，所得人工角膜在眼堿燒傷患者中的治愈率可達74.19%，可見所制備的角膜膠原蛋白膜對眼部堿燒傷的治療具有非常良好的效用。Myung等[29]使用異型雙功能交聯(lián)劑將角膜中的Ⅰ型膠原蛋白共價交聯(lián)至聚乙二醇/丙烯酸聚合網(wǎng)絡水凝膠中，構建了一種生物聚合物。通過對比無膠原蛋白交聯(lián)的水凝膠可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過膠原蛋白交聯(lián)的生物凝膠物質(zhì)能明顯支持角膜細胞的生長，且能有效支持傷口愈合。

3.2.3 人工骨

構建組織工程化人工骨的支架材料一般有兩類，一類是人工合成材料，另一類是天然生物材料，人工合成材料經(jīng)降解后容易產(chǎn)生酸性物質(zhì)，對細胞和組織的生長帶來一定的影響，天然生物材料機械性能差，也不適宜單獨用作支架材料，因此現(xiàn)在都是研究復合型人工骨，一般都將羥基磷酸鈣與膠原復合來制備人工骨，因為這兩種成分是動物、人體中骨骼的主要成分[1]。Moran等[30]將純化的牛膠原蛋白與羥基磷酸鈣、β-磷酸三鈣和自體骨髓混合制成了人工骨，并將人工骨和自體骨分別移植入兩組骨折病人體內(nèi)，并進行對比。結果發(fā)現(xiàn)兩組病人的愈合率相同，復合骨組的感染率要明顯低于自體骨組，可見復合人工骨可以替代自體骨用于骨折創(chuàng)傷，具有良好的安全性和有效性。

4 結語與展望

就目前而言，我國的膠原蛋白生物材料主要來源于牛、豬等陸生動物組織，而我國作為水產(chǎn)大國，可以充分利用豐富的水產(chǎn)資源來開發(fā)運用水產(chǎn)膠原蛋白，根據(jù)目前的研究看來，從水產(chǎn)副產(chǎn)物中提取的膠原蛋白具有良好的凝膠性、低粘度性等特點，可在某些方面替代陸生動物組織膠原蛋白，不僅能有效運用于膠原生物材料的研發(fā)，也利于提高水產(chǎn)品的附加值，同時，膠原蛋白獲取途徑的不斷開拓，也會使不同來源膠原蛋白產(chǎn)品的開發(fā)成為廣大學者的研究方向。

膠原蛋白在生物醫(yī)學材料等領域有著非常廣泛的應用，而組織工程的出現(xiàn)更是為膠原蛋白的應用提供了一個前景廣闊的平臺，目前所形成的包括縫合線、各類醫(yī)用敷料、組織工程材料等在內(nèi)的許多產(chǎn)品，在實驗及臨床研究中均取得了很大的成功，但是，目前市場上真正廣泛使用的膠原產(chǎn)品較少，部分產(chǎn)品還未投入批量生產(chǎn)，同時新產(chǎn)品的開發(fā)也需要進行長期、大量的實驗研究與臨床驗證，因此，膠原蛋白用作生物材料的研發(fā)，還需要實驗人員和生產(chǎn)者們進一步深入研究，這也將是生物技術時代的重要研究內(nèi)容之一。

同時，國內(nèi)針對膠原蛋白及膠原蛋白相關產(chǎn)品的標準較少，且部分企業(yè)標準對產(chǎn)品的定義尚未明確，容易使消費者混淆。隨著我國膠原蛋白行業(yè)的發(fā)展以及越來越多相關產(chǎn)品的研究開發(fā)，將膠原蛋白及相關產(chǎn)品標準化也顯得尤為重要。