基于網絡藥理學分析痛瀉要方治療克羅恩病的作用機制

袁紅昌，逯中民，陳 穎，朱 煜，楊明瑞，趙金金

(新鄉醫學院第一附屬醫院 1 藥學部，2 檢驗科，新鄉 453100)

克羅恩病是一種反復發作的腸道炎癥疾病，病變部位多見于回腸末端和鄰近結腸處，有時可累及整個消化道。臨床表現為腹瀉、腹痛、無肉眼血便或黏液血便，可出現腹部腫塊、肛門病變及腸瘺等癥狀。中醫認為克羅恩病屬于“泄瀉、痢疾、便血”等范疇，病理過程類似“肝郁脾虛、脾氣受損”證候。痛瀉要方源于《丹溪心法》[1]，由白芍、白術、陳皮、防風4味中藥組成，是治療肝旺脾虛痛瀉的代表方劑。后世醫家吳昆《醫方考》卷二之泄瀉門曰：“痛瀉不止者，此方主之。”脾胃為后天之本，若因外感時邪、情志失調、飲食所傷，皆可損傷脾胃，脾胃虛弱，氣血化源不足，導致肝陰血不足，肝用失制，肝氣疏泄太過，肝旺乘脾，脾虛失運，升降失司，水濕不化，濕熱蘊積腸胃而發病，故治療應從柔肝祛風、健脾溫中化濕[2]。痛瀉要方常用于補脾抑肝，治療肝郁脾虛腹瀉[3]。痛瀉要方的有效成分、作用途徑、靶點多，作用機制尚未完全闡明[4]。目前網絡藥理學已應用于中藥學研究，可直觀地探索中藥與機體之間的相互作用，從整體水平觀察中藥的療效，為復雜的作用機制研究提供了新的方向和思路[5]。本研究采用網絡藥理學構建藥物-疾病靶點網絡探索痛瀉要方的藥理作用，以及治療克羅恩病的作用機制。

1 方法

1.1 收集疾病靶點

通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站檢索克羅恩病的疾病基因，物種為“homo sapiens(human)”，查詢“Crohn disease”和“Crohn’s disease”關鍵詞，采用Pheatmap R包刪除重復的疾病靶點。通過篩選閾值(P<0.05)得差異性基因，采用基因表達數據庫(GEO)進行差異性基因分析，logFC>0和logFC<0分別為上調基因和下調基因，制作差異基因的火山圖。

1.2 預測痛瀉要方的活性成分及靶點

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)網站查詢痛瀉要方中白芍、白術、陳皮、防風4味中藥的活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%以及藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件篩選有效化合物。文獻顯示[6-7]，白術內酯Ⅰ(atractylenolide Ⅰ)和白術內酯Ⅲ(atractylenolide Ⅲ)為白術的主要活性成分，因此本研究納入這2種成分。預測活性成分的作用靶點。

1.3 構建化合物-疾病靶點網絡圖

篩選痛瀉要方的活性成分和克羅恩病靶點交集的靶點蛋白。利用Cytoscape 3.7.2軟件包構建痛瀉要方-克羅恩病靶點的網絡圖，節點為痛瀉要方的活性成分和克羅恩病靶點；邊為成分與靶點之間的作用關系。

1.4 構建PPI網絡

利用Cytoscape 3.7.2軟件BisoGenet包構建蛋白質相互作用(PPI)網絡，PPI數據庫來源于BIOGRID、HPRD、DIP、INTACT、MINT、BIND，物種為“homo sapiens(human)”。利用Cytoscape 3.7.2軟件CytoNCA包對PPI網絡進行拓撲分析，選取度中心性(degree centrality，DC)和介數中心性(betweenness centrality，BC)指標大于節點中位數的節點，分析其藥理作用。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

采用ClusterProfiler R包對靶點進行基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。以P<0.05(閾值)表示生物學功能有統計學差異，制作細胞組分(cell components，CC)、生物學過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)圖。采用Cytoscape 3.7.2構建基因與KEGG之間的關系網絡圖，以P<0.05(閾值)表示有統計學差異。

2 結果

2.1 疾病靶點

經收集和篩選后，共得克羅恩病的靶點基因434個，上調基因和下調基因分別為249個和185個。見圖1。

注：黑色為對照組和克羅恩病組無差異性基因；紅色和綠色分別為克羅恩病組上調基因和下調基因圖1 差異性基因的火山圖

2.2 痛瀉要方的成分及靶點

篩選痛瀉要方的活性化合物28個(數據截至2020年5月23日)，包括山柰酚(kaempferol)、芍藥苷(paeoniflorin)、兒茶素[(+)-catechin]等4個白芍成分；β-乙酰氧基蒼術酮(β-acetoxyatractylone)、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ等5個白術成分；柚皮素(naringenin)、米橘素(citromitin)、川陳皮素(nobiletin)等4個陳皮成分；白花前胡乙素(anomalin)、歐前胡素(ammidin)、防風色酮醇(ledebouriellol)等16個防風成分；β-谷甾醇(β-sitosterol)為防風和白芍的共同成分。

2.3 化合物-疾病靶點網絡圖

28個化合物和15個疾病靶點構成了痛瀉要方-克羅恩病疾病靶點的網絡圖，含節點43個和邊71條。重要的疾病靶點為二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP4)、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2，NOS2)、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARG)等；痛瀉要方的主要化合物為白術內酯Ⅰ、山柰酚、

川陳皮素等。見圖2和表1。

注：紅色為疾病靶點；黃色、藍色、灰色、紫色和青色分別為防風、白芍、陳皮、白術及共同成分圖2 痛瀉要方-克羅恩病靶點的網絡圖

2.4 PPI網絡及靶點

經篩選DC和BC指標后得NOS2、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、微小染色體維持缺陷蛋白2(minichromosome maintenance 2，MCM2)等135個靶點蛋白。見圖3和表2。

表2 痛瀉要方-克羅恩病靶點的基本信息

(續表)

2.5 GO功能分析

BP富集較多的有對細菌源性分子反應(response to molecule of bacterial origin)、脂多糖反應(response to lipopolysaccharide)、小分子代謝過程調節(regulation of small molecule metabolic process)、脂肪酸反應(response to fatty acid)等566個生物學過程；CC富集較多的有低密度脂蛋白粒子(low-density lipoprotein particle)、膜微結構域(membrane microdomain)、膜區域(membrane region)、內體膜(endosome membrane)等28個生物學過程；MF富集較多的有蛋白酶結合(protease binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、受體配體活動(receptor ligand activity)等7個生物學過程。

2.6 KEGG通路富集分析

結果顯示，15個靶點在16條信號通路上富集有統計學差異(P<0.05)，主要通路為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路、白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)信號通路、百日咳(pertussis)、類風濕關節炎(rheumatoid arthritis)、核因子-κB(nuclear factor-кB，NF-κB)信號通路等。

2.7 KEGG與基因關系網絡

結果顯示，由10個基因和16條信號通路構成關系網絡圖，含26個節點和43條邊；重要的基因為環加氧酶2(PTGS2)、趨化因子配體2(CCL2)及白細胞介素-1β(IL1β)等；重要的KEGG通路為百日咳、IL-17信號通路、利什曼病及類風濕關節炎等。見表3。

表3 痛瀉要方-克羅恩病靶點的信號通路

3 討論

克羅恩病的病因較多，與感染和免疫紊亂等因素有關。文獻報道[8]，Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)是一種蛋白復合體，誘導IL-1β的分泌和成熟，與克羅恩病的發生高度相關。當結腸發生感染和黏膜損傷時，通過IL-1β激活刺激T細胞增殖引起黏膜免疫應答。克羅恩病患者腸組織中Th1細胞和Th17細胞數量增多促進白細胞介素-17A(interleukin，IL-17A)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等細胞因子分泌增多，表達上調，激活NF-κB炎癥信號通路，誘導或加重炎癥反應[9-10]。研究表明[11]，克羅恩病是由Th1/Th17介導的炎癥反應，IL-17、IFN-γ、TNF-α等高表達引起效應T細胞與調節T細胞分化失衡。在克羅恩病發生過程中，TNF-α誘導IL-12促進Th1細胞分化和增殖[12]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)作為p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和NF-κB等傳導信使激活細胞內的信號通路，影響細胞的增殖、分化及凋亡[13]。腸炎患者中 IL-1β 含量升高，但也有報道稱IL-1β引發間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植，減輕結腸炎[14-15]。因此，IL-1β在黏膜免疫應答的作用仍未完全闡明。

痛瀉要方由白術、白芍、陳皮、防風4味中藥組成。中醫認為，白術利水化濕、健脾燥濕；白芍益陰柔肝、緩急止痛；陳皮理氣燥濕、醒脾健脾、化痰和胃；防風理氣止痛、勝濕止瀉，全方歸肺經和大腸經，通過補脾抑肝、緩急止痛治療克羅恩病[16]。研究表明[17]，白芍的主要成分有芍藥苷和兒茶素。芍藥苷具有抗炎、免疫調節、鎮痛、抗抑郁等生物活性[18]；兒茶素具有抗病毒、抗炎、鎮痛、解痙等作用。陳皮具有抗炎、抗氧化、調節免疫、抗癌等功效，用于治療脘腹脹滿、腹瀉或便秘；陳皮的主要成分有柚皮素、川陳皮素、β-谷甾醇。柚皮素和川陳皮素具有抗氧化、減少氧自由基和抗炎作用[16,19]；β-谷甾醇可抗炎、調節免疫。防風具有抗炎、鎮痛、抗菌等作用，可用于胃痛和胃腸炎治療，療效良好；防風的主要成分香豆素和色原酮具有抗病毒作用[20]。上述文獻報道的關于白術、白芍、陳皮、防風4味中藥的主要成分與TCMSP數據庫篩選的化合物靶點基本一致，說明采用網絡藥理學方法預測痛瀉要方主要靶點的準確性較高。

本研究通過IL-17、NF-κB、TNF等16條信號通路預測了芍藥苷、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ、柚皮素、川陳皮素、β-谷甾醇等28個活性成分對克羅恩病的治療作用。白術可降低IL-1β、TNF-α水平，減輕局部炎癥反應[21]，通過調節toll樣受體4(toll-like receptors 4，TLR4)/NF-κB信號轉導，抑制后續致炎因子生成，恢復Th1/Th2失衡[21]。白術內酯Ⅰ抑制白細胞分化抗原14(lipopolysacharide 14，又稱CD14)、TLR4、清道夫受體A類(scavenger receptor class A types，SR-A)的表達，減弱NF-κB活性，通過抑制TNF-α和IL-6產生抗炎作用[6]。白術內酯Ⅰ抑制NLRP3炎性體激活進而減少IL-1β[22]。白術內酯Ⅲ抑制NO、IL-6、TNF-α釋放，抑制小鼠巨噬細胞的炎癥反應。蒼術酮通過降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子水平，抑制p65及NF-κB表達，減輕炎癥反應[23-24]。芍藥苷改善2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導的結腸炎TNF-α等因子的合成，促進IL-10合成，抑制p38 MAPK激活，抑制TNF-α分泌，減輕結腸的炎癥[18]。山柰酚通過MAPK和NF-κB途徑抑制ROS產生[25]，調節NF-κB信號通路，發揮抗炎和抗氧化作用。陳皮調節IL-17、NF-κB、TNF等信號通路，發揮抗炎、保護肝臟、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[26]，還可調控低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路，影響NF-κB信號通路。

本研究應用網絡藥理學分析了痛瀉要方治療克羅恩病的作用機制，為研究中藥復方效應機制提供一些新思路。但同時也存在不足之處，如痛瀉要方的入血成分尚未完全明確，成分與疾病靶點的對接還有待進一步探索，以及缺少網絡預測結果的臨床和實驗驗證等，需進一步研究。