OsTZF9基因過(guò)量表達(dá)調(diào)控水稻多種生長(zhǎng)發(fā)育表型

周淑芬 劉寶 張迪

摘 要：RRTZF基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中起著重要作用。OsTZF9基因是水稻RRTZF基因家族的一員，為分析OsTZF9基因的生物學(xué)功能，構(gòu)建了由Ubiqutin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物過(guò)表達(dá)載體pCXUN-TZF9，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株6個(gè)克隆。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因植株后代的表型發(fā)現(xiàn)，與野生型日本晴相比，OsTZF9基因過(guò)表達(dá)植株的株高、分糵數(shù)、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)和千粒重均下降;與轉(zhuǎn)基因陰性分離株相比，OsTZF9基因過(guò)表達(dá)植株抽穗期推遲。

關(guān)鍵詞：水稻;OsTZF9基因;過(guò)量表達(dá);表型分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S 511?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：0253-2301（2021）11-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.11.001

Overexpression of OsTZF9 Gene Regulates Various Phenotypesof Growth and Development in Rice

ZHOU Shu-fen1，2， LIU Bao1，2， ZHANG Di1，2

（1. Institute of Biological Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China;

2. Fujian Key Laboratory of Agricultural Genetic Engineering， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： RR-TZF gene plays an important role in plant growth， development and stress responses. OsTZF9 gene is a member of rice RR-TZF gene family. In order to analyze the biological function of OsTZF9 gene， a plant overexpression vector pCXUN-TZF9 driven by Ubiqutin promoter was constructed， and 6 clones of transgenic regenerated plants were obtained by using the agrobacterium-mediated method. Further analysis of the phenotype of the progenies of the transgenic plants showed that plant height， tiller number， effective panicle number， panicle length and 1000-grain weight of the OsTZF9-overexpressed plants were decreased compared with those of the wild-type Nipponbare; compared with the transgenic negative isolated plants， heading date of the OsTZF9-overexpressed plants was delayed.

Key words：Rice; OsTZF9 gene; Overexpression; Phenotypic analysis

RRTZF基因是一類(lèi)植物特有的CCCH型鋅指基因，因其編碼蛋白含有1個(gè)TZF模體及其上游50個(gè)氨基酸為富含精氨酸區(qū)（RR）而得名。不同于保守的TZF模體（CX8CX5CX3HX18CX8CX5CX3H），RRTZF蛋白中的TZF模體是由中間間隔16個(gè)氨基酸的兩個(gè)不同CCCH結(jié)構(gòu)域組成[1-2]。通過(guò)全基因組學(xué)分析，目前已在多種植物中鑒定了許多RRTZF成員，如在擬南芥、水稻、玉米、高粱、大豆、苜蓿和楊樹(shù)中分別鑒定了11、9、12、6、22、5和16個(gè)RRTZF基因，它們受多種發(fā)育階段和環(huán)境信號(hào)的影響，在植物中的表達(dá)模式呈多樣化[3]。

除了擬南芥中所有RRTZF基因的功能得到一定程度的解析，其他植物中僅有少數(shù)RRTZF基因的功能獲得研究。水稻中，僅有OsTZF1和OsTZF2（OsDOS）兩個(gè)復(fù)制基因的功能研究較為深入。OsTZF1正向調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)、負(fù)向調(diào)節(jié)PHYB和PHYC介導(dǎo)的紅光與遠(yuǎn)紅光反應(yīng)、參與鹽脅迫反應(yīng)及JA誘導(dǎo)的葉片衰老[4];OsTZF2（OsDOS）通過(guò)JA誘導(dǎo)途徑負(fù)向調(diào)控水稻葉片衰老[5]。通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)OsTZF9基因在水稻的胚乳中特異性表達(dá)[6-7]，為了進(jìn)一步了解OsTZF9基因的功能，本研究構(gòu)建了OsTZF9基因過(guò)表達(dá)載體，獲得了過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株并進(jìn)行系統(tǒng)的田間表型調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因受體材料為粳稻Oryza sativa L.ssp.Japonica日本晴Nipponbare。

大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404、質(zhì)粒pCXUN和pCXUNTZF9，均由福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。pCXUN為植物過(guò)表達(dá)骨架載體， TDNA區(qū)包含攜帶由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因及Ubiquitin啟動(dòng)子（用于啟動(dòng)目的基因），pCXUNTZF9為OsTZF9基因過(guò)表達(dá)載體。

1.2 載體構(gòu)建

以日本晴基因組DNA為模板，用高保真酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase）PCR擴(kuò)增OsTZF9基因全長(zhǎng)，并用普通Taq酶進(jìn)行加A處理。所用的PCR引物為OsTZF9F：5′CAAAGCACATTGCAAACACAG 3′和OsTZF9R：5′GTAACACACCCATCTACACGAAG3′。

用Xcm I 酶切pCXUN質(zhì)粒，獲得3′末端突出1個(gè)T堿基的線(xiàn)性骨架載體，通過(guò)TA克隆法與上述OsTZF9基因全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物連接，挑單克隆測(cè)序獲得連接正確的OsTZF9基因植物過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

以日本晴成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織為農(nóng)桿菌侵染材料，經(jīng)過(guò)抗性愈傷組織的篩選、分化及生根獲得再生水稻植株，相關(guān)的培養(yǎng)基及試驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[8]。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

葉片浸泡潮霉素方法篩選轉(zhuǎn)基因植株：田間采取新鮮分蘗期待檢測(cè)水稻植株葉片，浸泡于50 mg·L-1的潮霉素溶液中，28℃光照培養(yǎng)3～5 d后統(tǒng)計(jì)水稻對(duì)潮霉素的抗感情況，葉片無(wú)褐斑為抗，即為轉(zhuǎn)基因植株;葉片出現(xiàn)褐斑為感，即為非轉(zhuǎn)基因植株。

PCR擴(kuò)增方法篩選轉(zhuǎn)基因植株：以CTAB法[9]提取的水稻葉片基因組總DNA為模板，用引物TZF9T1：5′TAGCCCTGCCTTCATACGC 3′和TZF9T2：5′TTGGTCGGGTCAATGGTTA? 3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段247 bp，包括Ubiquitin啟動(dòng)子和目的基因區(qū)域的DNA片段。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，預(yù)變性5 min;{94℃，45 s;56℃，45 s;72℃，45 s}，35個(gè)循環(huán);72℃，延伸8 min。

1.5 田間種植

選取OsTZF9基因過(guò)表達(dá)株系3個(gè)克隆（OT9-3、OT9-20和OT9-40）、野生型日本晴及轉(zhuǎn)基因陰性分離株進(jìn)行田間種植，每份材料種植成一個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植6行，每行栽7株苗，種植密度為20 cm×20 cm。

1.6 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)和結(jié)實(shí)率的調(diào)查：成熟后每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取非邊行的5～10個(gè)具有代表性的單株進(jìn)行分析，以它們的平均值作為每個(gè)株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)值。每株有效穗數(shù)統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)實(shí)籽粒大于或等于5粒的所有稻穗，測(cè)量所有有效穗穗長(zhǎng)的平均值為該株的穗長(zhǎng)，所有有效穗的結(jié)實(shí)率為該單株的結(jié)實(shí)率。

抽穗期調(diào)查：水稻抽穗時(shí)，每2 d調(diào)查1次各個(gè)小區(qū)中每個(gè)單株的始穗期，以每株主穗抽出1 cm作為該株始穗的標(biāo)準(zhǔn)，以從播種到始穗的天數(shù)為抽穗期。

粒重稱(chēng)量：每個(gè)小區(qū)選取6個(gè)具有代表性的單株，脫粒后于烘箱中烘干至恒重，每個(gè)單株飽滿(mǎn)種子重量除以各自種子粒數(shù)，然后再乘以1000即獲得每個(gè)單株千粒重，6個(gè)單株千粒重的平均值即為該株系的粒重。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用鄧肯方法進(jìn)行多重比較。結(jié)實(shí)率先通過(guò)反正弦化后再進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsTZF9基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

以日本晴基因組DNA為模板，用高保真酶PCR擴(kuò)增獲得了以日本晴為背景的OsTZF9基因全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物， PCR產(chǎn)物膠回收后用普通Taq酶加A尾巴，通過(guò)TA克隆方法與pCXUN線(xiàn)性載體連接，經(jīng)測(cè)序獲得了正向連接且序列正確的植物過(guò)表達(dá)載體，命名為pCXUNTZF9（圖1）。通過(guò)電激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞LBA4404，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR，獲得了能擴(kuò)出目的片段的陽(yáng)性單克隆并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的獲得

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將pCXUN-TZF9載體導(dǎo)入日本晴成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，共獲得了再生轉(zhuǎn)化植株50個(gè)克隆，每個(gè)克隆各選取2個(gè)單株共100個(gè)單株種植于大棚中。對(duì)各個(gè)單株進(jìn)行葉片潮霉素抗感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示：50個(gè)克隆100個(gè)單株中共有20個(gè)克隆39個(gè)單株（其中1個(gè)克隆只檢測(cè)到1個(gè)單株具有潮霉素抗性）具有潮霉素抗性。

進(jìn)一步對(duì)具有潮霉素抗性的39個(gè)單株葉片基因組DNA進(jìn)行PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅6個(gè)克隆12個(gè)單株能擴(kuò)出明亮的目的條帶（圖2）。對(duì)具有明亮條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為預(yù)期的目的序列。以上結(jié)果表明了OsTZF9基因過(guò)量表達(dá)載體的TDNA區(qū)成功地插入到水稻基因組中。

2.3 OsTZF9基因過(guò)量表達(dá)對(duì)水稻主要農(nóng)藝性狀的影響

系統(tǒng)調(diào)查OsTZF9基因過(guò)表達(dá)株系的田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，結(jié)果顯示，在分析的5個(gè)性狀中，除結(jié)實(shí)率外，3個(gè)不同轉(zhuǎn)基因克隆的過(guò)表達(dá)株系的其他4個(gè)性狀均與野生型日本晴（CK）存在顯著差異（表1）。過(guò)表達(dá)株系的平均株高為52.2～61.0 cm，比對(duì)照低8.0～16.8 cm;平均分蘗數(shù)為12.9～14.2個(gè)，比對(duì)照減少5.2～6.5個(gè);平均有效穗數(shù)為10.8～14.1個(gè)，比對(duì)照減少4.0～7.3個(gè);平均穗長(zhǎng)為12.0～13.4 cm，比對(duì)照減少2.1～3.5 cm。可見(jiàn)，OsTZF9基因過(guò)量表達(dá)對(duì)水稻的株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和穗長(zhǎng)具有抑制作用。

2.4 OsTZF9基因過(guò)表達(dá)對(duì)水稻粒重的影響

選取3個(gè)不同克隆的OsTZF9基因過(guò)表達(dá)T2代純合株系種植于田間中，對(duì)成熟期收獲的不同株系的種子進(jìn)行千粒重稱(chēng)量發(fā)現(xiàn)，OsTZF9基因過(guò)表達(dá)株系的平均千粒重15.5～21.5 g，均顯著低于野生型日本晴（CK）（23.3 g），其中OT920株系的千粒重最小，比對(duì)照減少7.8 g（圖3）。對(duì)上述3個(gè)克隆OsTZF9

基因過(guò)量表達(dá)株系繼續(xù)種植T3代，粒重分析結(jié)果顯示T3代的平均千粒重均明顯低于對(duì)照（圖4），說(shuō)明了OsTZF9基因過(guò)量表達(dá)降低水稻粒重具有遺傳穩(wěn)定性。

2.5 OsTZF9基因過(guò)量表達(dá)對(duì)水稻開(kāi)花的影響

前期田間性狀調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)OsTZF9基因過(guò)表達(dá)植株具有推遲水稻開(kāi)花的現(xiàn)象，進(jìn)一步選取3個(gè)不同克隆的OsTZF9基因過(guò)表達(dá)T1代植株進(jìn)行抽穗期調(diào)查，同時(shí)以轉(zhuǎn)基因植株后代陰性分離株為對(duì)照，結(jié)果顯示OsTZF9基因過(guò)表達(dá)植株的平均抽穗期為68～85 d，比對(duì)照推遲14～31 d（圖5）。繼續(xù)跟蹤調(diào)查OsTZF9基因過(guò)表達(dá)T2代植株抽穗期發(fā)現(xiàn)，3個(gè)不同克隆OsTZF9基因過(guò)表達(dá)植株的抽穗期均比陰性分離株長(zhǎng)（圖6）。以上結(jié)果，說(shuō)明了OsTZF9基因過(guò)量表達(dá)具有推遲水稻開(kāi)花的作用。

3 討論與結(jié)論

植物RRTZF蛋白是植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫反應(yīng)的一個(gè)潛在調(diào)節(jié)因子。擬南芥中， AtTZF2和AtTZF3基因過(guò)表達(dá)植株對(duì)ABA超敏感和耐旱性[10]，種子特異表達(dá)基因AtTZF4、AtTZF5和 AtTZF6是ABA、GA和光敏色素B（phyB）介導(dǎo)的種子萌發(fā)的負(fù)調(diào)控因子[11]。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中OsTZF9蛋白與谷蛋白基因GluB1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，OsTZF9基因RNAi植株種子中的總氮含量比對(duì)照高。本研究發(fā)現(xiàn)，OsTZF9基因過(guò)表達(dá)植株的千粒重下降。這些結(jié)果暗示了OsTZF9基因是一個(gè)水稻粒重和種子蛋白質(zhì)含量的負(fù)調(diào)控因子。

擬南芥RRTZF基因過(guò)量表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，不同RRTZF基因過(guò)表達(dá)植株具有一因多效的現(xiàn)象，且存在著一些相似表型[13]。如AtTZF1基因過(guò)表達(dá)[14]時(shí)，具有AtTZF11和AtTZF10基因過(guò)表達(dá)植株的抗寒和抗旱性，同時(shí)還具有AtTZF4、AtTZF5和AtTZF6基因過(guò)表達(dá)植株種子萌發(fā)推遲的現(xiàn)象;AtTZF4、AtTZF5和AtTZF6基因在擬南芥中組成型表達(dá)[11]時(shí)，出現(xiàn)了一系列和AtTZF1基因過(guò)表達(dá)類(lèi)似脅迫耐受表型。水稻中，OsTZF1 和OsTZF2基因過(guò)表達(dá)植株均表現(xiàn)多種表型[4-5]，而且它們均具有推遲水稻葉片衰老的現(xiàn)象。本研究也發(fā)現(xiàn)，水稻胚乳強(qiáng)優(yōu)勢(shì)表達(dá)OsTZF9基因組成型過(guò)表達(dá)時(shí)具有降低株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)和粒重及推遲抽穗等多效表型，它與OsTZF2基因過(guò)表達(dá)植株均具有推遲水稻抽穗的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明了植物RRTZF基因的功能可能具有一定的冗余現(xiàn)象，同時(shí)也暗示了它們可能通過(guò)一個(gè)保守的基本分子機(jī)制起著類(lèi)似的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]POMERANZ M C， HAH C， LIN P C， et al.The Arabidopsis tandem zinc finger protein AtTZF1 traffics between the nucleus and cytoplasmic foci and binds both DNA and RNA[J].Plant Physiol， 2010， 152： 151-165.

[2]WANG D， GUO Y， WU C， et al.Genome-wide analysis of CCCH zinc finger family in Arabidopsis and rice[J].BMC Genomics，2008（9）： 44-54.

[3]BOGAMUWA S P， JANG J C.Tandem CCCH zinc finger proteins in plant growth， development and stress response[J].Plant Cell Physiol， 2014， 55：1367-1375.

[4]ZHANG C， ZHANG F， ZHOU J， et al.Overexpression of a phytochrome-regulated tandem zinc finger protein gene， OsTZF1， confers hypersensitivity to ABA and hyposensitivity to red light and far-red light in rice seedlings[J].Plant Cell Rep， 2012， 31：1333-1343.

[5]KONG Z， LI M， YANG W， et al.A novel nuclear-localized CCCH-type zinc finger protein， OsDOS， is involved in delaying leaf senescence in rice （Oryza sativa L） [J].Plant Physiology， 2006， 141： 1376-1388.

[6]劉梅芳， 周淑芬， 徐桂磊， 等.一個(gè)水稻CCCH型鋅指蛋白基因的表達(dá)模式分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2008， 23（3）：225-230.

[7]周淑芬， 劉華清， 徐桂磊， 等.水稻種子發(fā)育期間特異性鋅指蛋白基因的篩選與分析[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， 2012， 9（2）：237-289.

[8]蘇軍，胡昌泉，翟紅利， 等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻明恢86高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系的建立[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2003， 18（4）：209-213.

[9]MURRY M G， THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res， 1980， 8（19）： 4321-4326.

[10]LEE S J， JUNG H J， KANG H， et al.Arabidopsis zinc finger proteins AtC3H49/AtTZF3 and AtC3H20/AtTZF2 are involved in ABA and JA responses[J].Plant Cell Physiol.， 2012， 53：673-686.

[11]Bogamuwa S， Jang J C.The Arabidopsis tandem CCCH zinc finger proteins AtTZF4，5 and 6 are involved in light- abscisic acid-and gibberellic acid-mediated regulation of seed germination[J].Plant， Cell and Environment， 2013， 36：1507-1519.

[12]CHEN Y， SUN A， WANG M， et al.Functions of the CCCH type zinc finger protein OsGZF1 in regulation of the seed storage protein GluB 1from rice[J].Plant Mol Biol， 2014， 84：621-634.

[13]POMERANZ M， FINER J， JANG J C.Putative molecular mechanisms underlying tandem CCCH zinc finger protein mediated plant growth， stress and gene expression responses[J].Plant Signaling & Behavior， 2011， 6（5）：647-651.

[14]LIN P， POMERANZ M， JIKUMARU Y， et al。The Arabidopsis tandem zinc finger protein AtTZF1 affects ABAand GA-mediated growth， stress and gene expression responses[J].The plant jounal， 2011， 65：253-268.

（責(zé)任編輯：柯文輝）