結球甘藍BoFBX117基因的克隆與表達分析

許 濤 魯正釗 夏冬健 萬 菁 姜書涵 宋江華

(安徽農業大學園藝學院，安徽 合肥 230036)

結球甘藍(Brassica oleraceavar.capitataL.)屬于十字花科蕓薹屬，又稱甘藍、包菜等，是在全國各地廣泛栽培并可周年供應的重要蔬菜作物之一[1-2]。近年來，由于甘藍種植區已擴大到北方保護地，生產上對耐低溫的品種需求逐漸提高[3-4]。而目前耐寒甘藍材料的篩選主要以人工在低溫條件下篩選，該方法易受環境影響，選擇效率較低，給生產帶來巨大的損失，因而開展甘藍耐寒基因的鑒定及標記其連鎖分子的輔助選擇，將大大提高耐寒甘藍的育種效率[5-6]。

F-box 基因家族是植物中最大的基因家族之一，根據其蛋白C 末端結構域的不同被劃分為不同的亞家族[7-9]。F-box基因編碼的蛋白能夠調節多種多樣的生命活動，如延緩植物衰老、調控植物開花以及響應生物脅迫、低溫和干旱等逆境脅迫[9-11]。潘櫻等[12]研究發現，F-box基因BlAFB2 可能在光皮樺(Betula luminifera)低氮脅迫響應中發揮調控功能。尹恒等[13]成功從谷子中克隆到與早期耐旱響應相關的F-box基因SiFBX。Liu 等[14]克隆了2 個F-box基因，發現其為sy-2 候選基因，可能與辣椒(Capsicum annuum)的溫敏性密切相關。Song 等[15]在苜蓿(Medicago sativa)中發現了部分F-box基因表達響應熱脅迫誘導。然而，關于F-box基因參與甘藍對溫度脅迫抗逆反應方面的研究卻鮮有報道。

本研究從結球甘藍中克隆了BoFBX117 基因cDNA 全長，分析結球甘藍BoFPB7 序列特征及BoFBX117 基因在低溫脅迫下的表達模式，以期為進一步研究BoFBX117 基因在結球甘藍耐寒性調節方面的功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以結球甘藍BoJF-16-1(JF)為試驗材料，用于克隆基因及分析基因在不同組織器官中的表達。以耐低溫品種BoZG-16-1(ZG)和低溫敏感品種BoYC-16-1(YC)為低溫脅迫處理的試驗材料。試驗材料均來自安徽農業大學園藝植物育種工程實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫脅迫處理和取材 結球甘藍3 個品種分別采用穴盤育苗培養，培養條件為12～16℃，光照時間為16 h/8 h(光照/黑暗)。對JF 品種的幼葉和蓮座期葉片、根、莖分別取樣，用于組織器官表達試驗。對ZG和YC 品種進行低溫處理，當植株長至6～7 片真葉時，將處理溫度設為4、2、0、-2℃，處理6、12、24 h 分別取葉片為樣品。以未處理(0 h)常規培養的ZG 和YC 植株葉片作為對照組(CK)。將樣品包裹在錫箔紙內，迅速置于液氮中并儲存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 結球甘藍BoFBX117 基因克隆 本研究前期已完成對結球甘藍F-box基因家族的鑒定，從中篩選出一個可能與低溫脅迫相關的基因BoFBX117。利用Primer Premier 5.0 設計全長引物，上 游 引物BoFBX117-F 為:ATGACTTCAGATGCTCTCAA，下游引物BoFBX117-R:TCAACTTGCCTCTTCGAACG。樣品總RNA 提取采用TRIzol 法根據RNA 快速提取試劑盒(成都百菲特科技有限公司)操作進行，并按照反轉錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)操作步驟合成雙鏈cDNA。以cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應程序:94℃預變性30 s，98℃變性10 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃終延伸2 min，30 次循環。反應體系(50 μL):2×Accurate Tap Master Mix 酶26 μL，cDNA 模板4 μL，上、下游引物各1 μL，補足ddH2O 18 μL。采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用DNA 凝膠回收試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)回收擴增產物，并與克隆載體pMD19-T 連接。得到的連接產物轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑取單菌落培養，獲得重組體，用質粒DNA 提取試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)提取質粒并進行質粒PCR 鑒定，鑒定正確后的陽性菌液送北京擎科生物有限公司測序。

1.2.3 結球甘藍BoFBX117 基因序列分析 將測序得到的基因序列與BrassicaDatabase ( http:/ /brassicadb.org/brad/)網站中下載的序列進行比對；利用在線軟件 ProtParam ( https:/ /web. expasy. org/protparam/)分析BoFBX117 基因編碼蛋白質的氨基酸組成和蛋白質理化性質；利用DNAMAN 軟件進行蛋白質的多序列比對，并通過MEGA6.0 進行蛋白質系統發育進化樹的構建。

1.2.4 結球甘藍BoFBX117 基因表達分析 通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RTqPCR)檢測BoFBX117 在結球甘藍JF 不同組織器官中的表達情況；檢測分析ZG、YC 隨著處理溫度的不同(4、2、0、-2℃，處理時間為24 h)以及在4℃條件下不同處理時間(0、6、12、24 h)該基因的表達量差異。以GAPDH為內參基因，按照qPCR 引物設計原則設計引物，上游引物BoFBX117-F:CACAAGCAGTAAACCACA GTTC，下游引物BoFBX117-R:TGCTCTGCCAAGGTCA TAAG；上游引物GAPDH-F: GCTAACTGCCTTGCTCCA CTT，下游引物GAPDH-R:CGGCTCTTCCACCTCTCCAG T。

以結球甘藍低溫處理葉片cDNA 為模板，進行RT-qPCR 表達差異分析。20 μL 反應體系如下:10 μL KOD SYBR qPCR Mix、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL cDNA 溶液(已稀釋)、6 μL ddH2O。RT-qPCR 反應程序:98℃預變性，2 min；98℃變性，10 s；55℃退火，10 s；72℃延伸，1 min；循環40次。循環結束后從55℃上升至95℃，每10 s 上升0.5℃，繪制融解曲線，以檢測引物擴增的特異性。采用2-ΔΔCt法計算各樣品基因表達量。

1.2.5 數據統計與分析 采用Origin 8.0 和SPSS 17.0 統計軟件對試驗數據進行統計分析并作圖，用Duncan 新復極差法進行方差分析(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 結球甘藍BoFBX117 基因克隆

以結球甘藍JF 葉片cDNA 為模板，利用RT-PCR技術克隆獲得了大小為936 bp 的條帶(圖1)。經測序驗證后，獲得了目的基因的cDNA 全長。該基因位于結球甘藍5 號染色體上，命名為BoFBX117。GenBank 登錄號為XM_013731217.1。

圖1 BoFBX117 PCR 擴增電泳Fig.1 BoFBX117 PCR amplification electrophoresis

2.2 BoFBX117 編碼蛋白的序列特征

BoFBX117 基因編碼311 個氨基酸(圖2)，在第58～第105 氨基酸之間存在一個F-box 保守結構域，屬于F-box 蛋白家族。該氨基酸序列與已登錄的其他植物的FBP7 相似性較高，命名為BoFBP7。利用ProtParam 在線工具對BoFBP7 蛋白的理化性質預測分析，結果表明，化學式為C1620H2521N451O451S11，不穩定指數為51.01，大于40，屬于不穩定蛋白[16]。分析BoFBP7 蛋白序列可知，氨基酸殘基含量最高的是Arg(R)，占比9.6%；Lev(L)和Val(V)含量其次，依次分別為9.0%和7.7%，Cys(C)含量最低，占比為1.3%，預測編碼蛋白的分子量為30.14 kDa，理論等電點為9.71。

圖2 BoFBX117 基因序列及其編碼的蛋白質氨基酸序列Fig.2 The BoFBX117 gene sequence and its amino acid sequence

2.3 結球甘藍BoFBX117 同源性與系統進化分析

利用NCBI BLAST 檢索得到其他植物已知的FBP7 蛋白與結球甘藍BoFBX117 所編碼BoFBP7 蛋白的氨基酸序列。BLAST 比對結果顯示，BoFBX117所編碼蛋白BoFBP7 與同屬的蕪菁(Brassica rapa)(RID58279.1)FBP7 蛋白親緣關系最近，同源性高達99.36%。與同科的蘿卜(Raphanus sativus) (XP _018437435.1)、山崳菜(Eutrema salsugineum) (XP_006416265.2、)、擬南芥(Arabidopsis thaliana) (NP_564150.1)的FBP7 蛋白親緣關系也較近，分別為98.39%、96.13%和92.26%。利用DNAMAN 軟件對包括結球甘藍BoFBP7 蛋白在內的13 種植物進行序列多重比對分析，發現不同植物的FBP7 之間具有較高的一致性，其一致性達到85.40%(圖3)。系統進化樹分析結果發現13 個物種的FBP7 蛋白分為三大分支，包括結球甘藍在內的10 種植物為一個分支，其中結球甘藍BoFBP7 與同屬的蕪菁FBP7 蛋白親緣關系最近，屬于同一分支(圖4)。

2.4 結球甘藍BoFBX117 基因的表達分析

圖3 結球甘藍BoFBP7 同源蛋白的多重比對分析Fig.3 Multiple comparative analysis of BoFBP7 homologous proteins in Brassica oleracea

圖4 結球甘藍BoFBP7 蛋白系統進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of BoFBP7 in Brassica oleracea

2.4.1BoFBX117 基因在不同組織中的表達 利用RT-qPCR 對BoFBX117 基因在結球甘藍JF 不同組織中表達進行分析。結果表明，BoFBX117 基因的表達具有顯著的組織特異性，其在蓮座葉中的表達量最高，是幼葉中表達量的7.3 倍；根中的表達量次之，是幼葉中表達量的7.2 倍；其次是莖，是幼葉中表達量的3.3倍；而在幼葉中表達量最低(圖5)。

圖5 BoFBX117 基因在不同組織器官中的表達Fig.5 Expression of BoFBX117 gene in different tissues and organs

2.4.2BoFBX117 基因低溫處理的表達模式分析為研究BoFBX117 基因在低溫脅迫條件下的表達特性，采用不同低溫和不同時間對結球甘藍幼苗進行處理，并對BoFBX117 基因的表達情況進行分析(圖6)。在不同低溫處理下，BoFBX117 在品種YC 中的相對表達量隨溫度降低逐步增加，在-2℃達到最大值，其表達量是對照組的4 倍。品種ZG 除2℃處理外，其余處理表達量均顯著升高，在0℃達到最大值，是CK 表達量的19.2 倍。對比分析兩品種，在CK 和-2℃處理中，ZG 的表達量顯著低于YC；而在4℃和0℃處理中，ZG 表達量顯著高于YC。結果表明，結球甘藍BoFBX117 基因的表達受低溫脅迫的誘導，隨著溫度降低BoFBX117 基因的表達量總體呈上升趨勢。

圖6 BoFBX117 基因在低溫脅迫處理下的表達Fig.6 Relative expression of BoFBX117 gene under low temperature

在不同脅迫時間下，品種YC 中BoFBX117 的相對表達量先增后減，在脅迫6 h 最高，是CK 表達量的3.6 倍，脅迫12 h 時表達量是CK 的1.2 倍，而脅迫24 h 時表達量較CK 下降了84%。在品種ZG 中，除脅迫12 h 基因相對表達量較CK 有所下降外，其他處理組相對表達量逐步上升，并在脅迫24 h 達到最高，是CK的3 倍。將兩品種對比分析時，YC 在脅迫6、12 h 條件下，表達量均高于ZG，而處理24 h 時，表達量顯著低于ZG。結果表明，該基因在耐脅迫品種和低溫敏感品種中存在表達差異，而在這兩個品種中的表達差異反映該基因與結球甘藍不同品種耐寒性強弱可能有密切聯系。

3 討論

在自然條件下，植物的生長會受到內部或外部的脅迫刺激，面對這些脅迫，生物體已經進化出多種調節機制來協調其生命活動，其中F-box 蛋白酶體途徑是最重要的生物調節體系之一[9，17-18]。本研究應用RTPCR 技術克隆得到BoFBX117 基因的cDNA 全長為936 bp，編碼311 個氨基酸，分子量為30.14 kDa，理論等電點為9.71。該基因編碼的BoFBP7 蛋白在N 端含有典型的F-box 結構域，屬于F-box 蛋白家族，這種結構域通常介導蛋白質-蛋白質相互作用，其保守序列較少，僅有幾個位置的氨基酸殘基比較保守[19-20]。此外，結球甘藍BoFBP7 蛋白與同屬蕪菁的FBP7 親緣關系最近，同源性達到99.36%。與同科的擬南芥AtFBP7 同源性也高達92.26%，這表明結球甘藍BoFBX117 所編碼FBP7 蛋白與其他植物的FBP7 蛋白有密切的遺傳關系。據報道，擬南芥AtFBP7 是響應溫度脅迫的F-box 蛋白，在寒冷和高溫條件下，該蛋白表達量變化明顯[21]。推測，結球甘藍BoFBP7 蛋白可能也發揮著相似的生物學功能。

已有關于F-box基因參與擬南芥、番茄(Solanum lycopersicum)和小麥(Triticum aestivum)等植物非生物脅迫調控的研究報道。小麥中F-box基因TaFBA1 能夠響應多種非生物脅迫[22-24]，能在植物不同器官中調控多個靶位點來優化植物生長發育。在干旱、氧化及鹽脅迫條件下，超表達TaFBA1 的轉基因煙草生長發育情況優于野生型。在擬南芥中MAX2 是一種多功能的F-box 蛋白，它不僅在多種信號傳導中起調節作用，還能調控光形態發生、響應生物及非生物脅迫[25-27]。但在結球甘藍中相關的研究還非常有限。本研究對BoFBX117 基因在低溫脅迫誘導下表達情況進行了分析，發現該基因響應低溫脅迫誘導，這為進一步了解該基因在響應結球甘藍非生物脅迫中所發揮的作用奠定了一定的基礎。

研究發現，F-box基因在植物葉片發育中起作用。Baute 等[28]研究發現，玉米(Zea mays)F-box基因ZmFBX92 在擬南芥中異位表達能夠導致擬南芥的葉片增大，而擬南芥中同源基因AtFBX92 超表達后，則觀察到相反的作用，推測可能與F-box 蛋白FBX92 影響細胞分裂導致細胞數量不同有關。Liu 等[29]研究發現，番茄中F-box基因SlGID2 的轉基因株系葉片細胞更小更緊湊，而當其沉默后植株便出現矮化。本研究中，BoFBX117 基因在結球甘藍JF 幼葉和蓮座葉中的相對表達量存在顯著差異，推測在植株的生長過程中，結球甘藍BoFBX117 基因可能在調控葉片細胞分裂數量和大小方面發揮重要功能。

已有研究結果表明，低溫脅迫會誘導F-box基因的表達。據報道，辣椒(Capsicum annuum)F-box基因CaF-box受低溫脅迫誘導[30]。對雜草稻和栽培水稻低溫處理時發現，F-box基因OsF-BOX28 被誘導表達[31]；Wang 等[32]研究發現擬南芥F-box 蛋白CPR1與UBC13 相互作用以響應低溫脅迫。本研究中，結球甘藍BoFBX117 基因受低溫誘導，表達量隨處理溫度的降低而呈現上升趨勢，且在耐低溫品種和低溫敏感品種中表達量存在顯著差異，暗示BoFBX117 基因可能在結球甘藍耐寒機制中具有重要功能，這將為后續結球甘藍耐寒生理及分子機制研究提供線索和思路。

4 結論

本研究應用RT-PCR 技術克隆得到BoFBX117 基因cDNA，全長為936 bp，編碼311 個氨基酸，屬于Fbox 蛋白家族，該基因在結球甘藍蓮座葉中的表達量最高，根次之，在幼葉中的表達量最低，表現出明顯的組織特異性，且受低溫脅迫誘導表達，說明該基因可能參與植株抵御低溫脅迫的過程。本研究結果為進一步研究F-box基因在結球甘藍抵御低溫脅迫中的調控機制奠定了基礎，為抗逆品種篩選及提高結球甘藍等作物對低溫脅迫的適應能力提供了思路和方向。