基于術前人B-淋巴細胞趨化因子1檢測的肝細胞癌患者肝切除術后復發預測模型的構建及分析

李明蔚， 高 見， 翟相威， 錢相君， 文夏杰， 姚明解， 段昭君， 趙二江， 張 玲， 魯鳳民，

1 鄭州大學公共衛生學院 流行病學教研室， 鄭州 450001； 2 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院， 上海市腫瘤研究所， 癌基因及相關基因國家重點實驗室， 上海 200032； 3 北京大學基礎醫學院 a.病原生物學系暨感染病中心， b.人體解剖學與組織胚胎學系， 北京 100191； 4中國醫學科學院 基礎醫學研究所， 北京協和醫學院基礎學院 免疫學系，北京 100005； 5 鄭州大學附屬腫瘤醫院 a.病案室， b.肝膽胰外科， 鄭州 450008

肝細胞癌(簡稱肝癌)占全球癌癥發病率的第5位、男性癌癥死亡率的第2位[1]以及我國癌癥發病率的第4位，嚴重危害人民的生命與健康。近年來，隨著射頻消融、經肝動脈化學栓塞等非手術治療技術的引入，肝癌的臨床治療手段有了一定的進展。患者的術后復發與多種因素相關，已有研究者[2]將腫瘤因素、肝功能狀態、手術方式等納入肝癌復發模型。目前，姑息性手術切除仍是中晚期肝癌的選項之一，但由于患者術后復發時間短、預后差，對部分患者是否應行姑息手術存在爭議。本研究對接受肝切除術的患者進行分析，試圖從術前的血清學檢查中發現與肝癌術后復發相關的指標，以便在術前對患者預后進行評估。人B-淋巴細胞趨化因子1(C-X-C Motif Chemokine Ligand 13，CXCL13)是趨化因子家族中的一員，主要與人體細胞表面的G蛋白耦聯受體結合，主要分布在肝臟、淋巴結等器官組織中。CXCL13作為CXCR5(C-X-C chemokine receptor type 5)的唯一配體，是人類免疫系統的重要組成部分[3]，其在腫瘤患者中的水平高于健康人群和慢性乙型肝炎患者[4]。本實驗室前期研究[5]發現，在低分化的腫瘤組中，CXCL13和CXCR5在腫瘤組織中高于癌旁組織，并且證實了CXCL13水平與無復發生存相關而與總生存無關。也有研究[6]報道CXCL13基因缺失的大腸癌患者具有更高的復發風險。但是，CXCL13對術后肝癌患者預后的意義并不清楚。本研究對接受肝切除術后的肝細胞癌患者的術前血清學指標進行分析，嘗試建立可用于術前評估患者能否從姑息性肝切除中獲益的評價體系，為開展個體化的治療選擇提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性納入2009年2月22日—2013年7月13日在鄭州大學附屬腫瘤醫院行肝切除術且完成隨訪的111例患者，隊列失訪率為11.81%，其基本信息已在實驗室前期文章匯總進行描述[5]。納入標準：接受肝切除術并最終病理診斷為肝細胞癌的患者。排除標準：(1)臨床資料缺失嚴重；(2)肝切除術前接受其他方式治療。對符合納入標準的患者采用門診查詢、電話咨詢等方式進行隨訪。出院3個月后患者復查時進行首次門診查詢，未復查者進行電話咨詢，出院后1年內每3個月隨訪1次，2～3年內每6個月隨訪1次，4～5年內每年隨訪1次，詢問其生存狀態，復發情況。肝癌復發定義為影像學檢查發現腫瘤灶。隨訪至2014年7月25日，在隨訪期間內，當患者出現復發或死亡時，記錄其無復發生存時間及復發狀態。

1.2 研究方法 從電子病歷中收集患者的基本狀況：性別、年齡、腫瘤數目、腫瘤大小、肝硬化情況、Child分級、BCLC分期以及術前最后1次血清學檢測數據[AFP、總膽汁酸(TBA)、TBil、ALT、AST、前白蛋白(PA)、RBC、Alb、Glo、白球比(A/G)、ALP、GGT、淋巴細胞/單核細胞比值(LMR)、中性粒細胞/淋巴細胞比值(NLR)、PLT、PT、國際標準化比值(INR)、纖維蛋白原(FIB)等]。患者手術麻醉前抽取血液，1500 r/min離心5 min，收集血清，凍存至-80 ℃，轉運過程中使用干冰運輸。2014年于北京大學采用ProcartaPlexTMMultiplex Immunoassays (Affymetrix，圣地亞哥，加州，美國)試劑盒檢測患者血清CXCL13水平。根據2011年原發性肝癌診療規范[7]中根治性切除的Ⅲ級標準，將患者的手術方式分為姑息性切除和根治性切除。

1.3 倫理學審查 本研究經北京大學生物醫學倫理委員會批準，批號：IRB00001052-12088，所有參加者均獲得書面知情同意。

陳凱等[13]根據腫瘤因素建立了肝癌術后早期復發風險的模型，包含腫瘤直徑、腫瘤數目、血管侵犯和肝外侵犯。周正等[2]則將手術方式、腫瘤因素和肝功能狀態一同考慮，將手術器械、肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤數目、腫瘤分化程度等一同構建模型，其AUC為0.74，特異度為85.3%，靈敏度為52.3%。Pan等[14]將HBsAg同腫瘤數目、癌栓、分化程度、血管浸潤等構建了列線圖，并在驗證隊列中得到證實。葉穎劍等[15]在血清AFP陰性的肝細胞癌患者中發現腫瘤直徑、腫瘤包膜和血管侵襲性與患者的復發相關。肝癌的復發與機體狀態、腫瘤因素及手術因素等多種因素相關[2,15-17]。不同于以往研究，本研究主要是基于CXCL13及其他術前血清學指標對患者的復發情況進行分析，具有簡單易行的特點；特別是針對行肝癌姑息性切除的患者，可以從一定程度上提示術后復發風險，對0～3個月姑息手術切除患者的靈敏度高達93.75%，有助于臨床醫師進行臨床診療決策。原發性肝癌診療規范(2019年版)[18]的根治性切除界定是根據術中和術后的判斷標準進行的，不再有姑息性切除的描述。但術前基于血清學指標對預后的判定，對是否選擇外科手術治療仍有價值。但本研究也存在著一定局限性，如僅基于血清學指標進行分析的可靠性問題及樣本量較小等，仍需大樣本數據進行進一步分析及驗證。

2 結果

2.5 Cox模型對姑息和根治術后復發預測效能的比較 進一步將患者按照姑息性切除和根治性切除分組，分別分析模型在姑息性切除和根治性切除后不同時間段的預測效能。結果顯示該模型在各個時間段內對姑息性切除的預測效能均優于對根治性切除的預測效能(表5)。該模型對姑息性切除0～3個月的AUC最高為0.87，其靈敏度和特異度分別為93.75%和70.00%。

表1 肝切除術后未復發組和復發組患者術前指標比較

2.2 不同水平的指標對術后復發的影響 將連續性變量按照中位數分為高值組和低值組，AFP、FIB、ALP、GGT、CXCL13、BCLC分期不同分組之間的中位復發時間的差異具有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。Kaplan-Meier曲線顯示AFP、ALP、GGT、FIB低值組及CXCL13高值組的中位復發時間更長，而隨著BCLC分期的進展，中位復發時間縮短(圖1)。

2.3 與術后復發相關聯的因素及預后模型構建 將單因素分析中有差異的變量納入多因素Cox回歸分析，顯示AFP、GGT、CXCL13為復發的獨立因素[風險比(HR)(95%CI)分別為1.69(1.03～2.79)、1.89(1.14～3.14)、0.540(0.33～0.89)，P值分別為0.039、0.014、0.015](模型系數Omnibus檢驗，χ2=4.323，P<0.001)(表3)。以此3個參數構建復發模型的風險函數表達式為h(t)=h0texp(0.526×AFP+0.637×GGT-0.616×CXCL13),預后指數(Prognostic Index，PI)為：PI=0.526×AFP+0.637×GGT-0.616×CXCL13。PI最低值為-0.62，最高值為1.16，在全部患者中的中位數為0.53(0.00～0.55)。

有研究[4,8-9]報道，隨著肝癌臨床分期的進展，患者血清CXCL13的濃度逐漸升高，且CXCL13水平與ALT、腫瘤大小、Child評分呈正相關。血清CXCL13水平在肝癌患者中高于健康人群，在低分化組的肝癌組織中高于高分化組，CXCL13可以募集CXCR5陽性的濾泡輔助性T淋巴細胞和B淋巴細胞，促進IL-21和IL-12的分泌，對腫瘤產生抑制作用[5,9]，也可以誘發外周器官中的次級淋巴組織形成，參與機體的免疫[10-11]。本研究中顯示高水平的CXCL13患者擁有更好的預后，這可能與CXCL13作為免疫趨化因子參與機體的抗腫瘤免疫相關。

圖1 兩組的Kaplan-Meier曲線圖

太湖流域是一個不可分割的有機整體，上述水問題不是單獨、孤立的，許多是經濟社會發展過程中出現的新情況、新問題，這些問題相互關聯，互為因果，各種水問題之間存在著不可分割的聯系。鑒于太湖流域的水問題是流域性綜合性水問題，《太湖流域管理條例》的內容涉及防洪，供水，水資源配置、保護和水污染防治等諸多方面，為綜合性行政法規，重點將國家水資源管理與保護、水污染防治的法律制度在太湖流域具體化，對水環境實施綜合管理與治理，實行比其他流域更加嚴格的水資源管理、保護和水污染防治制度。

表3 與肝癌復發相關的單因素分析

總之，本研究證實通過檢測簡單易行的術前血清學指標可以對肝細胞癌姑息性切除術后患者的早期復發情況進行較為準確的預測，對于早期復發風險較高的患者，在選擇相關手術治療時應更為審慎，可嘗試采用其他聯合或代替治療的療法。

表4 Cox模型預測不同時間段復發情況的AUC、靈敏度及特異度

圖2 Cox模型預測3、6、12、24個月復發情況的ROC曲線

2.1 肝切除術后復發和術后未復發患者的術前指標對比 111例患者在隨訪期間發生術后復發71例(復發組)，未復發40例(未復發組)，隨訪人年為69.29年。復發組的術前AFP、TBil、GGT的水平高于未復發組，BCLC分期存在差異(P值均<0.05)(表1)。

表5 Cox模型預測姑息性切除和根治性切除不同時間段復發情況的AUC、靈敏度及特異度

3 討論

本研究對111例肝細胞癌肝切除術后隨訪患者的術前血清學指標進行Cox多因素分析，最終發現AFP、GGT、CXCL13是肝切除術后復發的獨立影響因素，其中AFP、GGT為獨立危險因素，CXCL13為獨立保護因素。這3個指標分別從腫瘤標志物、炎癥和宿主固有免疫3個方面預示著肝切除術后的復發風險。利用Cox建立復發預測模型，發現其對姑息性切除術后短期復發(0～3個月)預測的AUC最高，可幫助臨床醫師在一定程度上評估患者能否從姑息性切除術中獲益。

5.6.3 屈肘功能鍛煉 術后4～6周囑患者自然下垂患肩，健側手掌托著患肢前段，將肘關節上舉屈曲至110°，必須在深吸氣的同時上抬患肢前臂至屈肘位，開始時每天早晚訓練20次，每天鍛煉2次，以后逐漸增多，直到每天能達數千次。主要作用是加強膈神經對肌皮神經的支配，鍛煉肱二頭肌隨呼吸作屈肘動作，由練習摸嘴、摸頸到后來的摸腰部，逐步過渡到自主屈肘鍛煉。對尚未開始訓練的關節嚴格制動。

肝癌的復發分為早期復發和晚期復發，通常以術后2年為截止點[12]。本研究結果顯示，其預測肝癌切除術后3個月內復發的效能最高，隨著手術后生存時間的延長，該模型的預測能力下降。而考慮到接受姑息性切除的肝癌患者術后短期復發的患者可能更多，因此，根據患者的手術切除方式將其進一步分為姑息性切除和根治性切除，分別對該預測模型進行驗證。結果顯示該模型在不同時間段內預測姑息性切除復發的效果均優于根治性切除，同時對0～3個月復發預測的靈敏度最高，由此可見，該預測模型對術后短期復發的預測能力最佳，可用于預測姑息性切除術后的早期復發情況。

對RS碼進行盲識別，就是在僅知道v(x)的情況下，估計編碼參數進而還原出信息序列.若假定通過幀同步處理已經獲得(n,k)RS碼的起始位置，則需要識別的編碼參數包括碼長n，信息分組長度k和生成多項式g(x).

2.4 預測模型的ROC曲線 本隨訪研究隊列患者肝切除術后3～24個月的復發率為30.63%～60.36%。經ROC曲線評估上述Cox的預測模型的生存分析函數(表4)，結果顯示該模型對3個月復發風險的預測效能最高，AUC為0.82，靈敏度和特異度分別為91.18%和63.64%(圖2)。

據外媒報道，日本NHK(放送協會)電視臺從當地時間12月1日上午10點開始，正式開始通過衛星播送4K、8K電視信號。即使經過了數年測試，NHK仍是目前唯一提供8K、22.2聲道內容的電視臺。本次上線的電影是庫布里克的科幻經典《2001：太空漫游》，華納基于70mm底片進行了4K/8K重制。NHK之所以如此激進，可能與籌備2020年東京奧運會有關。

志謝：感謝所有參與本研究的患者及其家人的理解和支持，感謝姬旭慧、劉媛、謝霄夢等參與采集樣本及隨訪的研究生同學。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

在回歸模型Y=g(X)+ε中，當g(X)=E(Y|X)時，有GMC(Y|X)=R2。但R2主要用于回歸分析，GMC則可以用來測度隨機變量間的解釋方差。

作者貢獻聲明：李明蔚負責資料分析，撰寫論文；高見、姚明解、段昭君、趙二江參與收集及分析數據，修改論文；翟相威、錢相君、文夏杰參與資料分析與解釋；張玲、魯鳳民指導撰寫文章并最后定稿。