巨噬細胞對小鼠誘導多能干細胞向肝祖細胞分化的影響

宮甜甜，黃少剛，孫瑞珍，申景嶺，李秋明，雷 蕾，單智焱

1 哈爾濱醫科大學 組織學與胚胎學教研室， 哈爾濱150081；2 哈爾濱醫科大學大慶校區 組織學與胚胎學教研室， 黑龍江 大慶163319

肝祖細胞(hepatic-like progenitor cells,HPCs)在肝再生中發揮重要作用。HPCs的微環境是由細胞、細胞外基質成分以及這些細胞所釋放的生長因子和細胞因子組成的特殊微環境，這種特殊的微環境和不同成分間的相互作用影響HPCs的增殖和分化[1-2]。肝巨噬細胞具有吞噬異物、傳遞抗原、清除衰老細胞、參與免疫等作用，是構成肝組織微環境最重要的細胞之一；在肝損傷過程中，巨噬細胞可直接參與肝祖細胞的激活，促進肝損傷修復。研究[3]顯示，巨噬細胞對不同類型的干細胞也具有調控作用。巨噬細胞與造血干細胞共培養，能促進紅系細胞的分化。巨噬細胞還能促進骨髓間充質干細胞的成骨細胞分化[4]。本研究探討了巨噬細胞對小鼠誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)向HPCs分化的影響，為闡明HPCs發育的微環境作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞系 8～12周齡C57BL/6N(雌鼠)24只購自維通利華實驗動物技術有限公司；實驗動物生產許可證編號：SCXK(京)2016-0006，使用許可證編號：No.110011200107063283；體外誘導小鼠iPSCs細胞系(C1細胞)，為實驗室凍存。

1.2 主要試劑 DMEM/F12、Neurobasal培養基、KO血清替代物(KOSR)、雙抗(P/S)、非必需氨基酸(NEAA)、谷氨酰胺(L-Glu)、N2、B27、丙酮酸鈉(Na-Pyr)、β-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol)等試劑均為美國Gibco公司，DPBS、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶明膠等均為美國SIGMA公司。

1.3 HPCs的建立過程及向肝細胞分化 將C1細胞接種在明膠上，培養液為ESM(高糖DMEM)，15% ES級別胎牛血清(ES-FBS)，100 U/L P/S，1%NEAA，2 mmol/L L-Glu，1 mmol/L Na-pyr，1000 U/L白血病抑制因子(LIF)，0.1 mmol/L β-巰基乙醇。生長3 d后，將培養液更換為添加10 ng/ml-骨形態發生蛋白4(Bmp4)和LIF的CDM培養液(DMEM/F12，Neurobasal培養基，5%ES-FBS，1%P/S，1% L-Glu，0.5× N2，0.5 ×B27)。2 d后，將C1細胞消化，以2×105個細胞/孔接種在Ⅰ型膠原包被的6孔板上，培養液更換為添加20 ng/ml 激活素A(ActivinA)和1 mmol/L丁酸鈉(NaB)的CDM培養液(此時記為誘導第1天，D1)，培養2 d。D3，去除NaB，繼續培養2 d。D5，將細胞消化，重新接種在明膠包被的6孔板上，用添加20 ng/ml ActivinA，20 ng/ml Bmp4和20 ng/ml 成纖維細胞生長因子(FGF)的CDM培養液培養。D7，將培養液更換為HPCs培養液，繼續培養至D12。HPCs向肝細胞分化，將iPSCs-HPCs以5×105/孔接種在 Ⅰ 型膠原包被的6孔板上，無血清的CDM培養液添加10 ng/ml表皮生長因子(EGF)，10 ng/ml人類生長因子(HGF)，10 ng/ml抑瘤素 OCM，1% 二甲基亞砜(DMSO)，10-7mol/L地塞米松，培養6 d。

1.4 巨噬細胞的獲取 采用腹腔沖洗法獲得小鼠的巨噬細胞，在收集C57B/6N小鼠巨噬細胞的前3天，每只小鼠腹腔注射3 ml 硫膠脂注射夜。3 d后，斷頸處死小鼠，腹部向上放置于泡沫板上；用剪刀和鑷子切開覆膜的外側皮膚，使其暴露內層腹膜皮膚；用5 ml注射器抽取含3%FBS的PBS 5 ml注入小鼠的腹腔內，輕輕按摩腹部，沖洗腹腔內部的巨噬細胞；再用注射器將沖洗液吸出，注意避開脾臟和腸道，避免脂肪組織或其他組織堵塞。收集到的液體應為含有巨噬細胞白色細胞懸液，立即放入冰盒上的離心管內；重復沖洗3次后，在腹膜內皮上做一個切口，用鑷子揭開皮膚，用膠頭吸管吸取腹腔內剩余的液體。如果收集到的細胞懸液有明顯的血液污染，那么收集到的樣品應該棄掉。1000 r/min離心5 min后，即可獲得來源于小鼠腹腔的巨噬細胞。將巨噬細胞以1×106個/孔接種于6孔板內，更換CDM培養液培養24 h后，收上清即為Mc-CDM。將HPCs的誘導分為兩組進行，一組使用正常培養基，為對照組(Ctrl組)；另一組在HPCs誘導D5使用Mc-CDM培養基，為實驗組(Mc組)。

1.5 免疫熒光染色 iPSCs-HPCs接種于玻片培養48 h后，經PBS洗滌5 min/次，洗滌2次，4%PFA固定>30 min，PBS-T(PBS+0.25%Tritonx-110)洗滌5 min/次,洗滌3次;70%乙醇洗滌5 min，PBS-T洗滌5 min，封閉液(PBS-T+2%BSA)加入一抗避光室溫孵育2 h；PBS-T洗滌5 min/次,洗滌3次，二抗避光室溫孵育1 h；PBS-T洗滌5 min/次,洗滌3次；Hoechest 33342 染核，20 s；PBS-T 洗滌5 min；封片后熒光顯微鏡拍照。

1.6 PAS染色 HPCs接種于鋪有蓋玻片的6孔板，向肝細胞誘導分化至D6，經PBS洗滌5 min/次,洗滌2次，4%PFA固定>30 min，用PBS洗滌5 min/次,洗滌2次，高碘酸處理，去離子水洗滌10 min/次,洗滌2次，schiff染液10 min，去離子水洗滌10 min/次,洗滌 2次，Mayer蘇木素復染15～30 s，去離子水洗滌10 min/次,洗滌2次，脫水，中性樹脂封片。

1.7 Western Blot 將樣品及Maker按順序加入泳道，電泳、轉膜，5 %脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗，于4 ℃冰上孵育過夜。用 PBST洗去未結合的一抗，10 min/次，洗滌3次；加入二抗室溫孵育1 h；用PBST洗去未結合的二抗，10 min/次，洗滌3次；避光配制ECL工作液，滴加在PVDF膜上，顯影。

1.8 倫理學審查 本研究經哈爾濱醫科大學大慶校區倫理委員會審批，批號：HMUDQ2020102201，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 iPSCs-HPCs的建立 將小鼠iPSCs細胞系C1向HPCs誘導，誘導流程見圖1a。形態學上可見，C1在明膠上呈單層細胞生長。加入NaB后, C1增殖能力降低，大量細胞出現凋亡。去除NaB后, D5細胞開始增殖，呈扁平克隆狀生長。D8細胞開始鋪路石狀生長，且增殖旺盛；D12大部分細胞均為鋪路石樣，并呈圓形攤開生長(圖1b)。收集誘導D12的細胞，進行免疫熒光染色，可見誘導D12細胞高表達肝祖細胞相關基因CK19和ICAM(圖1c)。上述結果表明成功獲得了iPSCs-HPCs。

注：a，HPCs誘導流程圖；b，細胞各個誘導階段的形態圖(×10)；c，免疫熒光染色檢測誘導D12細胞中CK19 及ICAM的表達(×20)。圖1 iPSCs-HPCs的建立

2.2 iPSCs-HPCs可分化為有功能的肝細胞 形態學上可見，與接種后D0相比，從誘導D2開始逐漸向肝細胞的形態轉變，細胞體積逐漸增大，從圓形或橢圓形逐步變為多邊形。誘導D6可見細胞中央出現較大的細胞核，有的細胞出現雙核結構，具有典型的肝細胞形態(圖2a)。取誘導D6細胞進行免疫熒光檢測，結果顯示這些細胞表達肝細胞特異標志物Alb(圖2b)；PAS染色可見細胞出現紫紅色沉淀，說明誘導D6細胞可合成糖原，這些細胞具有肝細胞合成肝糖原的功能(圖2c)。以上結果說明iPSCs-HPCs具有分化為肝細胞的潛能，且這些肝細胞具有合成糖厚的功能。

2.3 巨噬細胞促進iPSCs-HPCs形成 巨噬細胞形態及免疫熒光檢測(圖3a)結果顯示，巨噬細胞表達其特異性基因F4/80。形態學上(圖3b)，與Ctrl組相比，D8 Mc、D12 Mc組細胞形態相似，均為鋪路石樣扁平細胞，可見巨噬細胞對HPCs形態學無明顯影響。免疫熒光染色顯示，與D12 Ctrl組相比，D12 Mc組的肝祖細胞特異性蛋白CK19的表達顯著增高(0.901±0.072 vs 0.686±0.097，t=-3.093，P<0.05)(圖3c、d)。

2.4 巨噬細胞通過自噬提高iPSCs-HPCs功能 Western Blot結果與免疫熒光檢測結果一致，與D12 Ctrl組相比，D12 Mc組肝祖細胞相關基因CK19的表達顯著增高(1.922±0.103 vs 1.448±0.012，t=-7.881，P<0.05)；同時，D12 Mc組自噬相關基因LC3的表達高于D12 Ctrl組，差異有統計學意義(1.392±0.042 vs 1.101±0.048，t=-5.978，P<0.05)(圖4)。以上結果說明，巨噬細胞對iPSCs-HPCs的形成起到促進作用，其作用機制可能與巨噬細胞調控iPSCs-HPCs自噬水平升高有關。

圖4 兩組CK19和LC3的表達水平比較

3 討論

HPCs在鼠中亦被稱為肝卵圓細胞。在正常成體肝臟中比例很小，以休眠干細胞的狀態主要存在于赫氏小管(Hering管)和膽管樹終末處。在成熟肝細胞的再生能力嚴重受損的情況下，它們開始大量增殖，從終末膽管區向肝板滲透，并向肝細胞和膽管上皮細胞分化，從而在肝再生中發揮重要作用。為了在體外成功獲取穩定的，且在形態、結構和功能上與體內發育更接近的肝祖細胞，Zhou等[5]通過添加誘導因子，利用4步法，獲取了小鼠胚胎干細胞來源的肝祖細胞及肝細胞；Yanagida等[6]利用三維生物構建技術成功的獲得了人誘導多能性干細胞來源的HPCs。 這些生長因子、轉錄因子、microRNAs及小分子物質等對HPCs的形成、增殖和分化至關重要，而存在于干細胞周圍的各類細胞和細胞外基質的相互作用更是控制干細胞的行為和干細胞之間平衡的關鍵因素。

在肝組織內，定居著大量的肝巨噬細胞。肝巨噬細胞有強大的吞噬、吞飲能力，可清除機體的病原微生物、異物及衰老細胞；能殺傷腫瘤細胞，處理、傳遞抗原，參與免疫應答，在維持肝組織內的微環境等方面起著重要的作用。本研究發現巨噬細胞能夠促進HPCs的形成。在成體肝臟內，巨噬細胞參與維持HPCs靜息狀態表型，抑制其分化；在慢性炎癥時，巨噬細胞分泌相關細胞因子促進HPCs的激活[7]。本研究發現在iPSCs向HPCs分化過程中，巨噬細胞可能通過調控自噬，影響HPCs的形成，提高自噬促進iPSCs向HPCs分化。這與Chen等[8]的研究一致，自噬缺乏可導致HPCs干細胞特性缺失。HPCs可能通過增加自噬水平維持其自我更新和增殖能力。此外，研究[9]表明，自噬相關基因Atg7缺陷的血干細胞表現出線粒體損傷積累、活性氧水平升高和DNA損傷。在骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化的早期，通過抑制mTOR的負調控激活自噬，可以促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化[10]。這些研究表明，自噬在促進和維持成體干細胞的形成、自我更新和衰老中起著至關重要的作用[11]，而通過干細胞微環境中的巨噬細胞進行成體干細胞自噬的調控可能成為研究成體干細胞增殖分化的新方向。

肝臟非實質細胞，如巨噬細胞、間質、血管內皮細胞等可直接影響肝臟實質細胞的存活及肝功能。本研究初步驗證了巨噬細胞對iPSCs-HPCs的形成起到促進作用，其作用機制可能與巨噬細胞調控iPSCs-HPCs自噬水平升高有關。本研究采用巨噬細胞條件培養基的方式，實現了巨噬細胞的參與，但在空間上并沒有實現細胞之間的接觸，在今后的工作中，擬建立巨噬細胞三維共培養模式，實現細胞間的接觸，深入探討巨噬細胞促進HPCs形成的影響機制，為干細胞的體外誘導提供新的思路。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：宮甜甜、雷蕾、單智焱負責課題設計，資料分析，撰寫論文；黃少剛、申景嶺參與收集數據，修改論文；孫瑞珍、李秋明負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。