基于網絡藥理學的魚腥草滴眼液治療干眼作用機制探討△

農璐琪，劉自強，韓夢雨，訾迎新，鄧宇，孟歡，金明

1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中日友好醫院 眼科，北京 100029

干眼是近年來眼科門診常見疾病之一，是指任何原因導致的淚液的質、量或流體動力學異常造成的以眼睛干澀、燒灼感等眼部不適癥狀為主要臨床表現的疾病，中醫歸屬于白澀癥、神水將枯范疇，滋陰為其主要治療原則。魚腥草滴眼液是臨床眼科門診常用中藥滴眼液之一，主要用于治療急慢性角結膜炎等炎性眼表疾病。其主要組成為三白草科蕺菜的新鮮全草[1]，即魚腥草，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋等作用；藥理學研究證實魚腥草具有抗炎、抗病毒、抗菌等作用[2]。近年亦有采用魚腥草滴眼液治療干眼的研究[3]，收效甚佳。基于干眼與炎癥相關的發病機制，推測魚腥草滴眼液治療干眼與抗炎有關，但其治療干眼的作用機制尚不明確。

網絡藥理學是近年新興的用于研究中藥活性成分和作用靶點的新策略[4]，能夠從多方面闡釋藥物治療疾病的潛在作用機制，體現藥物作用的整體性和系統性[5]。本研究采用網絡藥理學方法，構建魚腥草-干眼的活性成分及作用靶點網絡，以期明確魚腥草治療干眼的作用機制，為臨床治療提供參考。

1 方法

1.1 魚腥草滴眼液活性成分收集

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw. com/tcmsp.php)檢索滴眼液主要組分魚腥草中含有的有效成分，根據化合物類藥性規則并結合魚腥草活性成分相關文獻對化合物進行篩選，設定篩選標準為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18或符合Lipinski類藥性五原則均納入，并結合魚腥草活性成分相關文獻對可能遺漏的有效成分進行補充[6-7]。

1.2 魚腥草作用靶點與干眼疾病靶點獲取

利用TCMSP中的藥物相關靶點預測功能，收集魚腥草有效成分的作用靶點，并使用UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)將靶點名稱統一轉換為基因名，合并重復靶點并刪除無對應基因名的靶點以便后續網絡拓撲圖構建。以關鍵詞“dry eye”“xerophthalmia”在GeneCards(https：//www.genecards.org/)和OMIM(https：//omim.org/)數據庫中進行檢索，得到干眼疾病相關靶點。對兩者取交集匹配，初步得到魚腥草與干眼相關的作用靶點，即魚腥草治療干眼的潛在作用靶點。

1.3 構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡拓撲圖

將所得到的魚腥草治療干眼的潛在作用靶點數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，進行可視化操作，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡拓撲圖。其中，節點代表魚腥草及其有效成分、干眼疾病、作用靶點等；邊代表魚腥草與有效成分、有效成分與作用靶點、干眼疾病與作用靶點之間的相互關系。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建與分析

將所得到的魚腥草治療干眼的潛在作用靶點數據輸入STRING數據庫(http：//string-db.org/)中，物種定義為“Homo sapiens”，即“人類”，構建魚腥草治療干眼的PPI網絡，去除無相互作用關系的靶點，輸出PPI網絡圖并統計關鍵靶點度(degree)值。

1.5 基因本體(GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用Bioconductor(http：//www.bioconductor.org/)數據庫R語言軟件包對魚腥草治療干眼的潛在作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，設定P<0.05，得到關鍵靶點及其參與和影響的關鍵功能和關鍵作用通路。

2 結果

2.1 魚腥草有效成分的篩選結果

TCMSP數據庫共收錄魚腥草化學成分50種，根據類藥性相關規則進行化合物篩選，并結合魚腥草活性成分相關文獻對可能遺漏的有效成分進行補充，得到包括癸醛、乙酸龍腦酯、山柰酚、槲皮素、蘆丁等在內的有效成分共30種，化合物名稱及相對分子質量(MW)、脂水分配系數(AlgP)、氫鍵供體數(Hdon)、氫鍵受體數(Hacc)、OB、DL數據見表1。

2.2 魚腥草治療干眼潛在作用靶點預測

共收集到魚腥草有效成分作用靶點347個，干眼疾病靶點3650個，藥物與疾病靶點取交集后得到潛在作用靶點128個。

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡拓撲圖分析

構建的魚腥草治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖如圖1所示，圖中共有節點153個，分別代表藥物魚腥草(綠色塊)、干眼(紅色塊)、有效成分(紫色塊)及基因靶點(藍色塊)；邊412條，代表各屬性之間的相互作用關系。從圖1中可以看出，魚腥草治療干眼的有效成分有23個，包括癸醛、乙酸龍腦酯、山柰酚、槲皮素、蘆丁等；根據Cytoscape 3.7.2軟件分析結果(表2)，其中起主要作用(與各靶點聯系較多，即度值較高的)的有山柰酚、槲皮素、蘆丁等。

表1 魚腥草有效成分

圖1 魚腥草治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點”網絡拓撲圖

表2 魚腥草治療干眼的核心化合物

2.4 PPI網絡分析

魚腥草治療干眼的潛在作用靶點之間PPI網絡構建見圖2，為顯示更簡潔，設定最小combined score>0.9。圖中蛋白質節點共128個，相互作用的邊383條，其中度值排名前20位的靶點見圖3，前10名關鍵靶點分別是Jun、蛋白激酶B1(Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、白細胞介素-6(IL-6)、轉錄因子p65(RelA)、白細胞介素-8(CXCL8)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)、MAPK8和IL-1β。

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集結果分析

圖4所示為魚腥草治療干眼的潛在作用靶點GO功能富集結果，可以看到潛在靶點參與調控的功能主要有細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、受體配體活動(receptor ligand activity)、細胞因子活性(cytokine activity)、核受體活性(nuclear receptor activity)等。

注：圖中圓圈代表蛋白；圈與圈之間連線代表兩者之間存在相互作用關系。

圖3 魚腥草治療干眼排名前20的靶點

魚腥草治療干眼的潛在作用靶點KEGG通路富集結果如圖5所示，主要富集在與糖尿病并發癥中的晚期糖基化產物及其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)、白細胞介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、缺氧誘導因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、細胞凋亡(apoptosis)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)等有關的通路上，提示魚腥草治療干眼的機制可能與抗晚期糖基化、抗炎、抑制細胞凋亡等相關。

3 討論

干眼是近年來得到廣泛關注的眼表疾病之一，截至2018年，全球的干眼發病率為5.5%～33.7%，我國的干眼發病率為21%～30%[8]。干眼的發病因素很多，包括環境、年齡、性別及全身性疾病在內的許多因素都會導致干眼[9]。此外，還有視屏終端綜合征、空氣污染等危險因素。中醫認為陰虛津虧、燥傷津液是干眼發病的主要原因[10]，而西醫則認為其發病除淚膜不穩定這一核心機制外，與眼表高滲透壓、眼表炎癥、神經感覺異常等機制亦有關聯[9]。針對這些病因，臨床干眼治療多從保持眼球濕潤、抗炎、滋陰等方面入手，西醫主要方法是使用針對病因的滴眼液點眼治療，此種方法作用效果單一，因此魚腥草滴眼液等中藥滴眼液近年在臨床使用日趨廣泛。

圖4 魚腥草治療干眼靶點的GO功能富集分析

圖5 魚腥草治療干眼靶點的KEGG通路富集分析

本研究通過構建魚腥草滴眼液治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點”網絡和PPI網絡，對魚腥草治療干眼的潛在作用機制進行探究。結果顯示，魚腥草在治療干眼時發揮核心作用的化合物有槲皮素、山柰酚和蘆丁，三者均屬黃酮類化合物，具有豐富的藥理活性，廣泛存在于食用和藥用植物中。實驗證實，山柰酚能夠抑制氧化應激反應發生[11]，減少TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表達，發揮抗氧化和抗炎作用；還可抑制凋亡蛋白表達，發揮抗凋亡作用[12]；此外還具有抗癌、保護神經等作用[13]。槲皮素作用與其類似[14]，除抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用外，還具有廣譜抑菌活性，對包括金黃色葡萄球菌在內的多種細菌發揮抑制作用[15]，而金黃色葡萄球菌是容易導致眼表炎癥的重要細菌之一。蘆丁可清除自由基，抗氧化作用顯著，亦可發揮抗病毒、抑菌、抗炎等作用[16]。

魚腥草治療干眼的PPI網絡分析結果顯示，轉錄因子Jun、Akt1、MAPK1、IL-6、RelA、CXCL8、VEGFA、EGFR、MAPK8和IL-1β10個靶點可能是與作用機制相關的關鍵靶點，而GO分析則提示，上述關鍵靶點通過影響細胞因子受體結合、受體配體活動、細胞因子活性、核受體活性、轉錄因子活性、整合蛋白結合等功能對干眼進行調控。干眼的發生發展過程涉及眾多細胞因子，這些細胞因子及其受體配體的活性影響炎癥、細胞凋亡等相關發病過程[9]。Jun參與了轉錄因子激活子蛋白-1(AP-1)的合成，轉錄因子AP-1不僅調控細胞的增殖、分化和轉化，還參與了體內免疫系統調控，從而能夠影響炎癥反應[17]。Akt1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調控細胞凋亡與生長增殖方面發揮著重要作用。CXCL-8即IL-8，與IL-6、IL-1β都是重要的炎癥介質，在干眼患者淚液及血液中的高表達證實了干眼由炎癥介導的發病機制，一定程度上對干眼的嚴重程度產生了影響[18-19]。它們與受體結合后能夠使多種炎癥因子釋放[20]，并導致信號轉導通路介導的生物效應發生，絲裂原激活的蛋白激酶通路就是其中之一。MAPK1和MAPK8均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，其表達與細胞生長發育相關。有研究表明，MAPK信號通路參與了高滲透壓導致的角膜上皮損傷，這是干眼發病機制的又一新線索[21]。RelA是核轉錄因子-κB(NF-κB)的一種蛋白質亞基，其翻譯后修飾能夠參與調控NF-κB的各項功能，如抑制細胞凋亡[22]。EGFR與相應配體結合后會激活相應通路控制相應細胞增殖分化，淚液中表皮生長因子(EGF)對于維持眼表微環境穩態具有重要意義[23]，而干眼的眼表微環境損害則可能與EGF表達下調有關。VEGFA為VEGF的一種，VEGF參與了糖尿病視網膜病變的發生發展過程，在糖尿病干眼患者淚液中有高表達[24]，VEGF及其受體與角膜損傷過程亦有密切的關系[25]。這些靶點都是魚腥草治療干眼的關鍵靶點，提示魚腥草治療干眼可能與抑制或阻止角膜上皮損傷形成有關。

根據KEGG通路富集分析結果，魚腥草治療干眼的潛在作用靶點主要富集在與炎癥、細胞凋亡、腫瘤代謝等過程相關的通路上，其中糖尿病并發癥中的晚期糖基化產物及其受體信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路和HIF-1信號通路顯著性較高。糖尿病晚期糖基化被認為是糖尿病角膜神經病變發生發展的重要因素[26]，而角膜神經病變可進一步引起淚腺功能受到抑制，進而導致干眼；該通路中包含的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號通路被證實與細胞凋亡密切相關，同時還能夠調節轉錄因子的結合，參與機體炎癥反應的調控過程[27]，發揮與TNF及IL-17相似的作用。HIF-1由α和β2個亞單位組成，其中HIF-1α能夠調控免疫細胞的存活和促炎因子的表達，同時作為介導缺氧信號的轉導中樞參與多條細胞信號通路，影響著與細胞增殖凋亡、腫瘤生長、細胞自噬等有關的各種生理過程[28]。

4 結論

綜上分析推測，魚腥草滴眼液治療干眼的作用機制是通過調節潛在作用靶點相關蛋白的表達，調控與炎癥反應、細胞凋亡等相關的通路，達到抗炎、抑制細胞凋亡等目的，從而抑制角膜上皮損傷，抑制干眼的發生發展。但這一結論僅是數據推測，存在一定的局限性，比如化合物篩選標準不全面，可能遺漏實際有效成分；疾病靶點數據庫范圍較小，可能不能囊括所有與干眼相關的基因靶點，推測結果可能與實際關鍵靶點不符等，故此結論仍有待后續實驗進一步論證。