柴銀口服液醇沉工藝對黃芩苷收率的影響△

張微，關永霞，韓振明，馮倩，馬健，杜昊忱*，張貴民

1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006

柴銀制劑是治療風熱感冒的三類中成藥，具有清熱解表、宣肺泄熱、化痰利咽止咳的功效，用于治療風熱之邪侵襲而致邪襲肺衛(wèi)之發(fā)熱惡寒、頭痛咳嗽、咽紅腫痛、舌邊尖紅、脈浮數(shù)之風熱表實證[1]。柴銀制劑具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)、解痙及清除氧自由基作用，其中有顯著的生物活性的黃芩苷為柴銀制劑的主要指標成分。現(xiàn)階段，單獨提取黃芩藥材中的黃芩苷時，主要采用水提酸沉法[2]、堿提酸沉法或乙醇直接提取法[3-4]。通過檢索，黃芩苷提取是國內外醫(yī)藥保健領域的研究熱點，但關于黃芩制劑合并提取、醇沉工藝的研究相對較少，主要原因為黃芩苷在冷水和醇中的溶解度低，導致黃芩相關制劑的醇沉過程會損失較大比例的黃芩苷，柴銀制劑的醇沉過程亦存在同樣問題。黃芩苷轉移率低是柴銀制劑質量提升的限制因素，柴銀制劑水提液含有糊化淀粉、脂溶性色素、油脂等，為保證中成藥的安全性、穩(wěn)定性和有效性，需要對提取液精制純化。

現(xiàn)代中藥生產常用的精制方法是醇沉除雜[5]，有關醇沉工藝及醇沉機制的報道較少[6]。醇沉工藝是一個除雜取精的過程，考慮所選溶劑含醇量、加醇方式、醇沉溫度、終點乙醇含量等多方面因素，目的是降低雜質在醇溶液中溶解度的同時有效成分溶解度可控而進行除雜取精。研究初期可以選用單因素試驗考察[7]，但無法綜合反映各因素之間的交互作用，而正交試驗是評價多因素共同作用的一個常規(guī)評價方法[8-10]，但正交試驗只反映醇沉工藝中“取精”的一面，無法反映 “除雜”在醇沉工藝的結果。

本研究將“取精”與“除雜”兩方面相結合。因中藥成分復雜、治療機制復雜，不可一味追求除雜，降低干物質量，要在兩者中找到一個平衡點來使其對立統(tǒng)一。本研究以黃芩苷的含量和醇沉上清液干物質量作為指標綜合評價，確定柴銀口服液最佳醇沉工藝。通過比較研究發(fā)現(xiàn)，醇沉一段時間內，黃芩苷保留率逐漸升高，達到最佳時間后黃芩苷的保留率反而下降，且醇沉時間對上清液所含干物質量影響不大。前期試驗發(fā)現(xiàn)，堿化乙醇2步醇沉后得到的黃芩苷含量高于簡單1步醇沉，因此，本研究將2步醇沉作為突破點，對其工藝條件進行探討。從大生產的安全性和實用性考慮，2步醇沉中預醇沉所用低濃度的堿化乙醇體積為清膏體積的2倍，醇沉時間選用最佳黃芩苷保留時間，易于實現(xiàn)大規(guī)模應用。因此，本研究采用正交試驗的方法對柴銀口服液提取的清膏進行醇沉工藝條件的優(yōu)化，并結合醇沉上清液的干物質作為評價指標，利用高效液相色譜法(HPLC)測定黃芩苷含量，篩選最優(yōu)醇沉工藝。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；R2002型旋轉蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；XS204型電子分析天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 試藥

柴銀口服液提取清膏(魯南厚普實驗室制備，密度為1.12)；高效液相用試劑均為色譜純；分析用試劑均為分析純；黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201821,CAS：21967-41-9，純度≥98%)。

2 方法

2.1 黃芩苷含量測定

黃芩苷含量測定方法參考《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版一部柴銀口服液項下HPLC測定黃芩苷含量的方法，柴銀口服液提取清膏液相色譜圖及黃芩苷對照圖譜見圖1，計算醇沉上清液黃芩苷含量，并按公式(1)計算黃芩苷轉移率(α)。

α=(醇沉上清液黃芩苷含量/柴銀口服液提取清膏黃芩苷含量)×100%

(1)

注：A.供試品溶液；B.對照品溶液。

2.2 干物質得率測定方法

干物質得率測定方法參考《中國藥典》2015年版四部通則0831“干燥失重測定法”，精密量取醇沉上清液10 mL，稱量，記錄上清液質量，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱，干燥至恒重，干燥器中冷卻至室溫，稱質量，按公式(2)計算干物質得率(δ)。

δ=(干物質質量/上清液質量)×100%

(2)

2.3 醇沉時間考察

稱取5份柴銀口服液提取清膏，每份35 g，分別以10 mL·min-1勻速加入pH=7、60%乙醇62.5 mL，再以10 mL·min-1勻速加入95%乙醇，使藥液終點乙醇體積分數(shù)為60%，于2～4 ℃溫度下靜置，分別于12、16、20、24、30、36 h取樣，并量取上清液體積，測定黃芩苷含量并計算黃芩苷轉移率，計算干物質得率。

2.4 醇沉工藝正交試驗設計

取柴銀口服液提取清膏，根據(jù)醇沉的影響因素及有效成分的性質，對預醇沉所用堿化乙醇的pH(A)、堿化乙醇含醇量(B)及二次醇沉所用高濃度乙醇的含醇量(C)進行考察。為使醇沉工藝更趨合理，本研究采用了L9(34)正交表進行正交試驗，開展醇沉工藝優(yōu)化。根據(jù)表1，取柴銀口服液提取清膏，每份含有黃芩苷5 g，共計9份，按設計方案進行醇沉。醇沉后攪勻，冷藏24 h，濾過，得醇沉上清液。以黃芩苷為考察指標，測定醇沉上清液中黃芩苷的含量。

表1 柴銀口服液提取清膏醇沉試驗正交因素水平

2.5 最佳醇沉工藝驗證實驗

按批次量擴大20倍稱取柴銀口服液提取清膏，共計3份，加入清膏體積2倍量的pH為8、含醇量為60%的堿化乙醇進行預醇沉，攪拌均勻后，再加入含醇量為85%的乙醇進行二次醇沉至醇沉液含醇量達60%，醇沉后攪勻，冷藏24 h，濾過，得醇沉上清液。

3 結果與分析

3.1 不同醇沉時間考察結果

不同醇沉時間對黃芩苷轉移率、干物質得率的影響結果見圖2。

注：A.黃芩苷轉移率；B.干物質得率。

由圖2A可知，在一定范圍內，隨著醇沉時間的延長，黃芩苷保留率逐漸升高。當時間超過24 h時，黃芩苷保留率反而開始下降，這是由于隨時間延長沉淀越來越板結，容易把黃芩苷包裹夾帶其中不容易釋放出來，再者隨時間延長，分子之間的范德華力也會使一部分黃芩苷沉降下來而造成的損失。圖2B則表明，醇沉時間對干物質得率影響不大，雜質在乙醇溶液中的析出在12 h內已達到平衡，再延長醇沉時間對雜質去除變化不大。綜上，確定最佳醇沉時間為24 h。

3.2 正交試驗結果與分析

3.2.1正交試驗測定結果 9組正交試驗指標測定結果中的黃芩苷含量、干物質得率與黃芩苷轉移率見圖3。

注：A.黃芩苷含量；B.干物質得率；C.黃芩苷轉移率。

3.2.2正交試驗測定結果方差分析、主效應分析與直觀分析 對黃芩苷轉移率進行方差分析，分析結果見表2。經方差分析可以看出，各正交試驗組之間黃岑苷保留率差異無統(tǒng)計學意義。

將黃芩苷轉移率進行主效應分析，見圖4。

表2 正交試驗醇沉上清液黃芩苷含量方差分析

圖4 9組正交試驗黃芩苷轉移率主效應圖

正交試驗醇沉上清液黃芩苷含量測定結果直觀分析見表3。由表3可知，堿化乙醇pH為8的高于pH為7和9的對醇沉黃芩苷損失影響；預醇沉堿化乙醇50%含醇量與60%含醇量比較，醇沉黃芩苷損失相差不大，預醇沉堿化乙醇含醇量60%略高于堿化乙醇含醇量50%和70%，二次醇沉含醇量85%略高于二次醇沉含醇量70%，且高于二次醇沉含醇量95%，堿化乙醇pH和堿化乙醇含醇量對黃芩苷影響差異無統(tǒng)計學意義，但二次醇沉含醇量對降低醇沉工藝黃芩苷的損失差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但A2B2C2均略高于預醇沉堿化乙醇含醇量50%和二次醇沉含醇量為70%的乙醇。因此，從實際生產考慮，醇沉工藝及之后乙醇回收過程中的時間、能耗成本和資源節(jié)約、操作方便性的角度考慮，及由正交試驗直觀分析和方差分析結果可以確定最佳醇沉工藝為A2B2C2，即預醇沉堿化乙醇pH為8，堿化乙醇含醇量為60%，二次醇沉乙醇含醇量85%。

表3 正交試驗醇沉上清液黃芩苷含量直觀分析

3.3 最佳醇沉工藝驗證實驗結果

對上述優(yōu)化后的醇沉工藝進行3批驗證實驗，3次醇沉上清液平均體積為77.05 L，平均黃芩苷轉移率為90.08%，結果與小試工藝優(yōu)選結果差異無統(tǒng)計學意義。通過3次平行驗證實驗，醇沉上清液體積和總黃芩苷含量的結果，其RSD均小于3%，表明工藝穩(wěn)定、合理。

4 結語

本實驗以柴銀口服液提取清膏為原料，研究了柴銀口服液醇沉工藝對黃芩苷轉移率的影響；在實際的生產過程中，醇沉工藝采用加入浸膏體積2倍量的預醇沉堿化乙醇pH為8、堿化乙醇含醇量為60%、二次醇沉乙醇含醇量85%，醇沉后上清液中黃芩苷轉移率最高為90.08%。該方法增加黃芩苷在醇溶液中溶解度，減少由于夾帶沉淀造成損失，依據(jù)相關物質的得失均衡，醇沉上清液中黃芩苷的含量體現(xiàn)有效成分的保留，醇沉上清液的干物質質量反映雜質的去除，從而達到醇沉工藝去除雜質而提高藥品療效的目的，因此，小試的最佳醇沉工藝可為中試和大生產工藝提供有利的數(shù)據(jù)支持。

該研究為柴銀制劑工業(yè)醇沉工藝提供實驗基礎，同時對于其他含有黃芩苷中成藥的醇沉工藝優(yōu)化也有借鑒作用。該醇沉工藝試驗結果表明，工藝穩(wěn)定，重復性好，可降低醇沉工藝對黃芩苷的損失，保證柴銀制劑大生產的產品中黃芩苷含量及臨床療效，為含有黃芩苷且有醇沉工藝的中成藥品種生產提供參考。