熊果酸通過調節miR-373-3p 對肺癌A549 細胞凋亡和遷移的影響

陳換換張小莉桑曉林馮 龍于瑩瑩宋超杰李志慧

(河南中醫藥大學,鄭州 450046)

肺癌是發病率和死亡率增長最快,對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,病因與許多因素密切相關,包括環境污染、吸煙、飲酒、職業因素等。肺癌的生物學特點為:侵襲性強、復發率高、生長速度快,預后效果差。大多數患者在確診時已發展至中晚期,多數已出現腫瘤的轉移和局部侵犯。目前,抗腫瘤藥物層出不窮,但肺癌患者五年生存率未顯著增加。因此,尋找有效治療方案,提高肺癌患者生存質量,是一個重要研究方向。越來越多的研究表明肺癌侵襲、增殖、轉移的發生與microRNA(miRNA)密切相關。

miRNA 是長度為18 ～25 個核苷酸的內源性小分子非編碼RNA,通過與目的基因mRNA3’端結合進而調控基因的蛋白表達,進而影響細胞增殖、分化、侵襲及凋亡的過程,參與疾病的發生發展[1]。miR-373 位于染色體帶19q13.4 上,屬于miR-371-372-373 家族,其前體 pre-miR-373 經過 Dicer 酶酶切后成為成熟的 miR-373-3p(又稱 miR-373) 和miR-373-5p,自然界絕大對數以 miR-373-3p 存在[2]。據報道[3],miRNAs 在人類癌癥中具有抑癌和致癌雙重作用。研究表明miR-373 在膽管癌[4]、鼻咽癌[5]、肝癌[6]、肺腺癌[7]中對腫瘤細胞的凋亡、遷移和侵襲發揮重要調控作用。據報道[8],miR-373 在肺癌A549 細胞中低表達,過表達miR-373 可通過靶向TFIIB 相關因子2(BRF2)抑制A549 細胞增殖、遷移和侵襲。

熊果酸(ursolil alid,UA)為五環三萜類化合物,可抑制多種腫瘤細胞生長[9-12]。Chen 等[13]研究表明熊果酸可通過靶向miR-149-5p/MyD88 通路減弱非小細胞肺癌干性。李姝葉等[14]研究報道熊果酸可通過下調miRNA-21 作用于PTEN/PI3K/AKT 通路抑制肺癌A549 細胞遷移、增殖和侵襲。目前國內外尚無文獻報導熊果酸調控肺癌A549 細胞的凋亡和遷移與miR-373-3p 表達有關。本研究旨在觀察熊果酸是否通過調節miR-373-3p 影響肺癌A549細胞的凋亡和遷移,為肺癌治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

肺腺癌A549,購于中國典型培養物保藏中心。

1.2 主要試劑

熊果酸、化療藥物順鉑均購自美國Sigma 公司;細胞培養用培養基RPMI-1640 以及 BCA 試劑盒,均購于北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清,購于德國 BI 公司; miR-373-3p 模擬物(miR-373-3p mimics)、無關對照(miR-373-3p scramble)、下游靶蛋白TXNIP 引物序列,均由上海吉瑪公司合成;AnnexinⅤ- FITC/PI 雙染,凋亡檢測試劑盒,購于美國BD 公司;TRIzol 試劑和脂質體2000 購自美國Invitrogen 公司;TXNIP 和GAPDH 抗體均購于Santa Cruz 公司。引物核苷酸序列見表1。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

用含10%胎牛血清RPMI-1640 培養基培養肺癌A549 細胞。將置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中,每隔1 d 換 1 次液。A549 細胞貼壁生長,當細胞匯合度達到約70%時,用胰蛋白酶消化、傳代,用對數期細胞進行實驗。

表1 引物的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequence of primer

1.3.2 細胞轉染

轉染前24 h,把濃度為 0.5×105/mL 的 A549 細胞均勻鋪至6 孔板中,每孔加入2 mL RPMI-1640培養液;轉染當日,細胞匯合度70%;根據Lip2000說明書進行細胞轉染,用適量OptiMEM 無血清培養液稀釋脂質體和mimics/scramble,室溫孵育5 min后混合,靜置20 min;將上述轉染混合液分別加入相應6 孔板中;37℃,5% CO2繼續培養 4 ～6 h;更換RPMI-1640 完全培養基,繼續培養24 h。

1.3.3 MTT 法檢測細胞活力

將濃度為4×105/mL 的A549 細胞均勻鋪至96孔板中,每孔再補充100 μL RPMI-1640 完全培養基,培養至細胞貼壁后,分別將 20、40、60、80、100 mol/L 熊果酸加入對應96 孔板中,同濃度DMSO 溶劑作空白對照繼續培養24 h;MTT 法檢測時,每孔加入20 μL 檢測試劑,避光孵育4 h;轉染miR-373-3p mimics 組和miR-373-3p scramble 組的檢測方法同上。檢測前,吸除每孔內的細胞培養液,每孔再加入 100 μL MTT 試劑,測定每孔的 OD 值。每個濃度設置3 個復孔。

1.3.4 RT-PCR 檢測 miR-373-3p 的表達

細胞轉染加藥24 h 后收集細胞,提取細胞總RNA;采用RT-PCR 法檢測轉染后細胞中miR-373-3p 表達水平變化。首先,將RNA 逆轉錄為 cDNA,并以cDNA 做為模板,U6 為反應過程的內參照,配制20 μL PCR 反應體系,反應步驟:96℃ 10 min,96℃ 20 s,60℃ 57 s,40 cycles。應用 2-ΔΔCT方法計算 miR-373-3p 的 相 對 表 達 量, ΔΔCT =(CTmiR-373-3p-CTU6)實驗組-(CTmiR-373-3p-CTU6)對照組。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

肺癌A549 在不同濃度的熊果酸作用下和轉染miRNA-373 mimics、miRNA-373 scramble 的 A549 細胞24 h 后,分別收集各組細胞;用4℃ 預冷的PBS磷酸鹽緩沖液洗滌細胞 5 遍。參照 Annexin VFITC/PI 雙染試劑盒說明書:先用490 μL 緩沖液懸浮細胞,再加入 5 μL Annexin V-FITC 染液,混勻,避光染色15 min;再加入5 μL PI 染液,避光染色5 min。FCM 檢測各組細胞的凋亡率。

1.3.6 Western blot 檢測凋亡蛋白TXNIP 表達

收集轉染miR-373-3p mimics 后的細胞提取總蛋白,BCA 法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合均勻,95℃,10 min 進行蛋白變性;在10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠,200 V 電壓下進行蛋白電泳;濕轉法將蛋白轉移至醋酸纖維素膜,60 min;5%脫脂奶粉,1.5 h,封閉非特異性蛋白;TBST 緩沖液洗滌醋酸纖維素膜,洗滌 5 遍,每遍 10 min;加入TXNIP 一抗(1 ∶2000 稀釋),4℃ 過夜;TBST 洗滌 5次,每遍 10 min; HRP 二抗(1 ∶500 稀釋) 室溫孵育2 h;TBST 洗 5 次,每遍 15 min。ECL 化學發光液顯影,Bio-Rad ChemiDoc MP 凝膠成像分析系統掃描膠片。

1.3.7 細胞劃痕實驗

以0.5×105的細胞數將肺癌A549 細胞接種于6 孔板中,當細胞貼壁后,用10 μL 的小槍頭在6 孔板底劃痕,然后用PBS 清洗3 次,在顯微鏡下進行細胞拍照。然后將不同組別的細胞分別在24 h 和48 h 后繼續拍照。細胞劃痕愈合率(%)= (0 h 劃痕寬度- 24 h/48 h 劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件分析數據,統計數據首先進行正態齊性檢測,對符合正態分布的數據用平均數±標準差(±s)進行描述;具備方差齊性時用單因素方差分析,當P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熊果酸對肺癌A549 細胞的活力的抑制效果

熊果酸用DMSO 稀釋后,按照如下的濃度梯度作用于A549 細胞。MTT 檢測結果顯示:與初始濃度 0 μg/mL 相比,熊果酸藥物濃度為 40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL 時,對肺癌 A549 細胞的抑制率明顯升高(P<0.001),IC50值為60 μmol/L。見圖1。

2.2 熊果酸能夠顯著升高A549 細胞中miRNA-373-3p 的表達

與轉染 miRNA-373-3p scramble 組相比, 轉染miRNA-373-3p mimic 后,A549 細胞中 miRNA-373-3p 表達顯著升高(P< 0.05)。說明瞬時轉染miRNA-373-3p mimic 能夠明顯提高 A549 細胞中miRNA-373-3p mimic 的表達。將 60 μmol/L 的 UA作用于轉染miRNA-373-3p mimic 的A549 細胞,與單獨 UA 組相比,24 h(16.787±3.109) 和 48 h(16.980±3.106),miRNA-373-3p 表達顯著升高(P<0.05)。說明UA 能夠使肺癌 A549 細胞內 miRNA-373-3p 的表達上調。見圖2。

2.3 miRNA-373-3p 促進肺癌A549 細胞凋亡

流式細胞術分別檢測miR-373-3p mimic+熊果酸組(46.20±5.970),miR-373-3p mimic 組(37.50±4.069),熊果酸組(29.10±4.281)以及miRNA-373-3p scramble 組(13.90±3.520)中 A549 細胞的凋亡情況。結果顯示:miR-373-3p mimic+UA,miR-373-3p mimic 組,UA 組細胞凋亡均明顯增加,并且與單獨使用 UA 組和轉染 miR-373-3p mimic 組相比,miR-373-3p mimic+UA 組細胞凋亡率明顯增加,差異有統計學意義(P< 0.001)。見圖3。

注:與 0 μg/mL 組相比,???P<0.001。圖1 熊果酸作用24 h 對肺癌細胞A549 的抑制作用Note.Compared with 0 μg/mL group,??? P<0.001.Figure 1 Inhibitory effect of ursolic acid on lung cancer cell A549 for 24 h

注:A: miR-373-3p scramble 組;B: miR-373-3p mimic 組;C: UA組;D: miR-373-3pmimic+UA 組; 與 miR-373-3p scramble 組相比,?P<0.05;與 UA 組相比,?P<0.05。圖2 各組細胞中miRNA-373-3p 的表達Note.A, miR-373-3p scramble group.B, miR-373-3p mimic group.C, UA group.D, miR-373-3p mimic+UA group.Compared with miR-373-3p scramble group, ?P<0.05.Compared with UA group,?P<0.05.Figure 2 Expression of miRNA-373-3P in each group

2.4 miRNA-373-3p 能夠上調TXNIP 基因 mRNA和蛋白表達水平

與miR-373-3p scramble 組相比,miRNA-373-3p+UA 組,miRNA-373-3p 組以及 UA 組肺癌 A549 細胞中TXNIP 蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05),TXNIP 基因 mRNA 表達也明顯升高(P<0.001)。提示:UA 可能通過調控miRNA-373-3p 的表達,作用于肺癌A549 細胞,從而促進凋亡蛋白相關基因TXNIP mRNA 和蛋白水平的表達。見圖4,圖5,圖6。

2.5 miRNA-373-3p 抑制肺癌A549 細胞遷移

細胞劃痕實驗結果顯示: 與 miR-373-3p scramble 組(65.12±3.29%)相比,UA 組(39.23±1.84%)、 miRNA-373-3p 組 (37.25 ± 3.31%) 和miRNA-373-3p+UA 組(34.33±2.08%)在 24 h 和 48 h 后,細胞劃痕愈合率有不同程度的降低。差異有統計學意義(P<0.001)。結果表明 miR-373-3p 能夠顯著抑制肺癌A549 細胞的遷移。見圖7。

3 討論

miR-373 在多種腫瘤中均檢測到異常表達,為癌基因或抑癌基因,影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡等生物學,可作為腫瘤早期診斷、治療靶點或預后監測的指標[15]。有研究[16]表明miR-373 在肝癌中發揮抗腫瘤作用,通過抑制Ras 相關蛋白Rab22a(一種癌蛋白)的表達及信號轉導降低腫瘤細胞的增殖和侵襲能力。Huang 等[2]研究發現miR-373 在鼻咽癌中表達下調,通過下調靶基因膜相關環指蛋白5 抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。Adi 等[17]發現miR-373 在肺腺癌組織中表達下調,但具體分子機制尚不清楚。

本研究發現miR-373-3p 在肺癌A549 細胞中低表達,通過流式檢測轉染 miRNA-373 mimics 的A549 細胞及細胞劃痕實驗發現,miR-373-3p 可促進肺癌A549 細胞凋亡并抑制細胞遷移,基于此,我們分析miR-373-3p 可能對肺癌A549 細胞的遷移、凋亡有一定調控作用。

熊果酸具有多種生物活性,如具有保肝、抗炎、抗腫瘤等[18-20]。研究發現[14]熊果酸通過下調PTEN/PI3K/AKT 通路下 miRNA-21 的表達,抑制肺癌A549 細胞增殖、遷移和侵襲。最新研究表明[13],熊果酸通過抑制miR-149-5p / MyD88 信號轉導降低A549 細胞增殖、分化和轉移。本研究發現熊果酸可抑制肺癌A549 細胞活力,顯著提高A549 細胞中 miR-373-3p 的表達,此外,與單獨熊果酸組和miRNA-373-3p mimic 組比,熊果酸作用于轉染 miRNA-373-3p mimic 的 A549 細胞中miRNA-373-3p 表達較高,由此我們推測熊果酸可能通過調控miRNA 分子促進肺癌細胞凋亡并抑制其遷移。

注:1:miRNA-373-3p+UA 組;2:miR-373-3p scramble 組;3:UA組;4:miRNA-373-3p 組。圖4 miRNA-373-3p 對肺癌細胞A549 內凋亡蛋白TXNIP 的表達Note.1, miRNA-373-3p+UA group.2, miR-373-3p scramble group.3, UA group.4, miRNA-373-3p group.Figure 4 Expression of the apoptotic protein TXNIP in lung cancer cell A549 by miRNA-373-3P

注:A:miRNA-373-3p+UA 組;B:miR-373-3p scramble 組;C:UA 組;D:miRNA-373-3p 組。與 miR-373-3p scramble 組相比,?P<0.05。圖5 miRNA-373-3p 對肺癌細胞A549 TXNIP 蛋白表達量的影響Note.A, miRNA-373-3p + UA group.B, miR-373-3p scramble group.C, UA group.D, miRNA-373-3p group.Compared with miR-373-3p scramble group, ?P<0.05.Figure 5 Effect of miRNA-373-3P on the expression of A549 TXNIP protein in lung cancer cells

注:A:miR-373-3p scramble 組;B:miR-373-3p mimic 組;C:UA 組;D:miR-373-3pmimic+UA 組。與 miR-373-3p scramble 組相比,???P<0.001。圖6 TXNIP mRNA 表達的比較Note.A, miR-373-3p scramble group.B, miR-373-3p mimic group.C, UA group.D, miR-373-3p mimic+UA group.Compared with miR-373-3p scramble group,???P<0.001.Figure 6 Comparison of TXNIP mRNA expression

研究表明硫氧還蛋白結合蛋白(TXNIP,thioredoxin-interacting protein)在腫瘤細胞中低表達,而且研究發現TXNIP 是潛在的抑癌基因[21],但其抑癌機制尚不明確。Chen 等[22]研究表明TXNIP 是miR-373 誘導上皮間質轉化的靶基因,miR-373 通過miR-373-TXNIP-HIF1α-TWIST 信號轉導通路促進乳腺癌細胞轉移。研究表明[23]組蛋白脫乙酰基酶抑制劑OBP-801 可誘導TXNIP 的蛋白表達抑制肺癌細胞的生長。本課題在肺癌A549 細胞中轉染了miR-373-3p 的模擬物,Real-time PCR 結果顯示,肺癌A549 細胞miR-373-3p 表達量顯著升高。經熊果酸作用后,Real-time PCR 結果顯示TXNIP 的表達亦顯著升高。因此,推測熊果酸可能通過促進miR-373-3p 誘導 TXNIP 的表達,從而抑制肺癌細胞生長。

綜上所述,本課題初步研究顯示熊果酸顯著促進肺癌 A549 細胞凋亡并且抑制細胞遷移,其作用機制可能是通過上調miR-373-3p 表達抑制肺癌細胞遷移和侵襲,為熊果酸應用于肺癌的基礎研究和臨床治療提供實驗依據。

注:A:UA 組;B:miRNA-373-3p 組;C:miRNA-373-3p+UA 組;D:miR-373-3p scramble 組。圖7 miRNA-373-3p 抑制肺癌A549 細胞的遷移Note.A, UA group.B, miRNA-373-3p group.C, miRNA-373-3p+UA group.D, miR-373-3p scramble group.Figure 7 miRNA-373-3p inhibits the migration of lung cancer A549 cells