鵝源星狀病毒TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法的建立及初步應用

蘇世博蒲路莎陳肖韓趙麗麗陳洪巖

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所/獸醫生物技術國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室/國家禽類實驗動物資源庫,哈爾濱 150069)

禽類星狀病毒(avian astroviruses,AAstVs)屬于星狀病毒科(astroviridae,AstV),其基因組長度介于7 kb到8 kb 之間,該病毒為單股正鏈RNA 病毒,無囊膜結構,粒子直徑為28 ～30 nm,呈二十面體星狀結構[1]。禽星狀病毒多發于養殖禽和少數鳥類,如火雞(TAstV)、鴨子(DAstV)、雞(CAstV)、珍珠雞(GFAstV)、鴿子(PiAstV)以及少數野生水生和陸棲鳥類[2]。據報道,通常情況下感染星狀病毒的禽類主要表現為病毒性胃腸炎、肝炎以及間質性腎炎[3-5]。然而自2017 年來,中國多個省份的鵝場都發現并報道了一種以致命的內臟和關節痛風為主要臨床特征的水禽傳染性疾病,該病多發于雛鵝,且具有高度致死性,死亡率為30%～50%[6]。病死雛鵝剖檢通常表現心、肝等主要臟器的痛風癥狀,其表面附著大量白色尿酸鹽顆粒,腎及腸系膜充血腫脹,嚴重者全身肌肉關節處均表現痛風。該病給禽養殖業帶來嚴重經濟損失[7]。經過病原學檢測,研究者們從各個地區臨床樣本中相繼分離并鑒定出一種與已報道的禽星狀病毒遺傳學差異較大的新型星狀病毒[8-12],并命名為鵝源星狀病毒(gooseorigin astrovirus,GoAstV)。與其他種屬星狀病毒基因組結構類似,鵝源星狀病毒基因組包含三個主要的開放閱讀框架(ORF1a、ORF1b 和ORF2),以及一個短的 5’非編碼區(UTR)、一個 3’UTR 和一個PolyA 尾巴[13-14]。ORF1 編碼非結構蛋白,在病毒復制中發揮作用,且較編碼病毒粒子衣殼蛋白(Cap)的 ORF2 序列更為保守。自 2018 年以來,黑龍江省[15]也出現了該病的大規模流行,其發病率高達80%,死亡率高達50%,這表明這種新型病毒正在向中國東北地區迅速傳播。經鑒定和測序分析發現該病毒與已報道的鵝源星狀病毒同源性高度相近,均不低于96.0%,遺傳進化分析表明它們屬于同一分支。但與其他禽類星狀病毒具有較明顯差異,其全基因組同源性僅為44.7%～60.5%。

早期,研究者僅能使用電子顯微鏡進行禽類星狀病毒的診斷[16],不利于大規模的臨床檢驗。由于該新型星狀病毒缺乏體外培養細胞系,且無血凝作用,使血清學檢測方法相對較少。普通RT-PCR 方法成為快速檢測該病毒的主要方式之一,但該方法敏感性低,無法對病毒定量分析,因此建立熒光定量PCR 方法十分必要。目前有研究者建立了SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR 方法[17],并探究了該病毒的組織嗜性。但相比于該方法,TaqMan 探針熒光定量在對目的基因進行絕對定量方面優勢明顯[18],于是本實驗以前期分離到的GoAstV HLJ01 株為毒種,利用參考毒株序列進行比對,并選取ORF1a 中的保守片段設計并合成特異性引物及探針,通過對反應條件的優化,建立標準曲線,并進行一系列的靈敏性、重復性及特異性實驗,最終建立一種更加高效特異的TaqMan 探針熒光定量PCR 方法,該方法將對GoAstV 的早期檢測及后期流行病學調查提供技術支撐,對該疾病的治療和預防更具指導意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

GoAstV HLJ01 株(GenBank 登錄號:MN175321.1)為本實驗室2018 年從黑龍江省大慶市某鵝場病死雛鵝肝、腎組織分離獲得。新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV) H1、H5、H9 的 HI 試驗標準抗原購自哈爾濱維科生物技術有限公司。鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、鴨腸炎病毒(DEV)、鵝細小病毒(GPV)、鴨肝炎病毒 1 型和 3 型(DHV-1、DHV-3)等由本實驗室保存。臨床樣品采自黑龍江省部分地區疑似發病的鵝養殖場5 月齡霍爾多巴吉鵝,共50份肛拭子。

1.2 主要試劑與儀器

TIANamp Virus RNA Kit 購于天根生化科技有限公司;Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit 均購自美國 OMEGA BioTek 公司;2×Taq PCR StarMix 購自GenStar 公司; T4 DNA 連接酶、pMD19-T 載體均購自于寶生物工程(大連)有限公司;DH5α 感受態細胞、TransStart Probe qPCR SuperMix、2,000 bp DNA Marker 購自北京全式金有限公司;組織研磨儀購自德國 QIAGEN 公司; 三槽 模塊 PCR 儀購 自SensoQuest 公司;Bio-Rad IQ5 熒光定量 PCR 系統購自于美國伯樂公司;凝膠成像分析系統購自美國Alpha technoch 公司;電泳儀購自北京六一儀器廠;超微量紫外分光光度計購自于德國IMPLEN 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物的設計和合成

從GenBank 中下載 GoAstV 參考序列,使用DNA STAR 軟件進行序列比對分析,并用Primer 5軟件對ORF1a 閱讀框中的保守區域設計一對擴增產物大小在400 bp 標準品引物(AstV-F-1050/AstVR-1428),利用其擴增產物制備標準品,在標準品序列中再選取一段長度為107 bp 的保守片段,設計熒光定量PCR 引物(PPF/PPR),同時設計一條5’端熒光基團為FAM,3’端淬滅基團為TAMRA 的特異性探針(Probe)。上述兩對引物及一條探針均由吉林庫美生物科技有限公司合成(表1)。

1.3.2 質粒標準品的制備

按照病毒RNA 提取試劑盒的說明書提取GoAstV HLJ01 株病毒RNA,并依照反轉錄試劑盒的說明以病毒RNA 為模板依次進行基因組DNA 的清除和病毒cDNA 的合成。以得到的cDNA 為模板,利用引物AstV-F-1050/AstV-R-1428 對標準品目的片段進行 RT-PCR 擴增。反應體系:2×Taq PCR StarMix 10 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 補充至 20 μL;反應條件:94℃ 5min;94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃40 s,34 cycles;72℃ 10 min;12℃終止。將 PCR 產物核酸膠電泳后在紫外凝膠成像系統下切取目的片段進行回收純化,并按照pMD-19T 連接體系連接克隆載體后轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞,挑取單菌落于LB 培養基中過夜培養,經菌液PCR 鑒定正確后提取陽性質粒送測序,將測序結果與理論相符的陽性質粒命名為pMD-19T-G,-80℃保存備用。測定pMD-19T-G 濃度,并進行10 倍的倍比稀釋,將其作為TaqMan 熒光定量PCR 方法的標準品。

1.3.3 熒光定量PCR 反應條件的優化

首先分別將引物(PPF/PPR)和探針稀釋至10 μmol/L,以總反應體系 20 μL、模板量 1μL、探針量0.4μL 為基礎,進行 TaqMan 熒光定量 PCR 反應,根據CT 值及曲線狀況摸索上下游引物的加樣量[19]。再以此濃度的上下游引物為標準,控制模板量不變,分別加入 0.2 μL、0.4 μL、0.8 μL 的探針摸索最佳的工作濃度[19]。

1.3.4 熒光定量PCR 標準曲線的建立

將標準品pMD-19T-G 進行10 倍梯度稀釋得到8 個稀釋度的質粒標準品(每微升1.50×102～1.50×109拷貝)作為模板,每個模板均做3 個重復,在優化得到的反應條件進行熒光動力學擴增,根據擴增曲線確定閾值并利用CT 值及模板起始拷貝數的對數之間的線性關系制作標準曲線并得出標準方程[19],同時以無菌水為模板設置陰性對照。

1.3.5 特異性實驗

為驗證該方法的特異性,提取GoAstV HLJ01 株、NDV、(AIV) H1、H5、H9、DTMUV、DHV-1 和 DHV-3的病毒基因組RNA,反轉錄合成cDNA;用病毒DNA試劑盒提取 GPV、DEV 和 MDPV 的基因組 DNA。利用上述建立的方法對提取的各種水禽病毒進行熒光定量PCR 反應,以無菌水為模板作空白對照。

1.3.6 敏感性實驗

鑒定該方法的靈敏度,使用DEPC 水10 倍梯度稀釋標準品質粒得到每微升1.50×109～1.50×102拷貝的質粒模板并進行敏感性檢測,采用無菌水作為模板作空白對照。檢測方法的靈敏度為以CT<35 且出現標準的S 型擴增曲線的最低濃度[20]。

1.3.7 重復性實驗

選取3 個稀釋度質粒標準品(10-2、10-4、10-6)進行檢測,并分別進行三次重復實驗;使用相同模板樣品在3 個不一致的時間點來進行批間重復性實驗。據以上兩批實驗得到的CT 值計算各自批內和批間的變異系數,以此來判定該方法的可靠性[21]。

1.3.8 臨床樣品檢測

使用普通RT-PCR 方法與本研究建立的探針法定量檢測樣品方法分別對從黑龍江部分地區發病鵝場采集的50 份疑似發病雛鵝的肛拭子進行檢測,利用檢測結果計算其符合率并判斷新方法的優越性。

表1 熒光定量PCR 相關引物Table 1 The primers used for the fluorogrnic quantitative PCR

2 結果

2.1 質粒標準品的構建

利用 AstV-F-1050、AstV-R-1428 引物對 HLJ01株進行常規RT-PCR 反應,獲長度400 bp 的單一條帶(圖1)。產物經膠回收純化后克隆、測序,結果與預期完全一致,將構建成功的陽性質粒命名為pMD-19T-G,-80℃保存備用。使用分光光度計測定質粒標準品 OD 值為:50.8 ng/μL。據公式得出 pMD-19T-G 標準品的拷貝數為每微升1.50×1010拷貝。

2.2 熒光定量PCR 反應條件的優化

經過多次試驗摸索后得到熒光定量PCR 最佳反應體系:2×Probe qPCR SuperMix 10 μL、探針(10μmol/L) 0.4 μL、上游引物(10μmol/L) 0.4 μL、下游引物(10μmol/L)0.4 μL、模板 1 μL、Nucleasefree Water 7.8 μL,總體系 20μL。反應條件為:94℃30 s;94℃ 5 s,60℃ 30 s,45 個循環;4℃終止反應。

注:M:DL2000 DNA Marker;1:目的基因; 2:陰性對照。圖1 目的片段PCR 結果Note.M,DL 2000 marker;Line 1,Objective fragments;Line 2,Negative control.Figure 1 Amplification products of the PCR test

2.3 標準曲線的建立

以稀釋好的8 個濃度梯度(1.5×102至1.5×109copies/μL)的質粒標準品作為模板,且每個梯度做4個重復進行熒光定量PCR 反應。分析擴增結果,分別以質粒模板量的對數值作為制作標準曲線的橫坐標,以熒光信號達到閾值時的循環數(CT)為縱坐標,繪制標準曲線,曲線方程為:Y=-3.179x+42.066。如圖2 所示每個濃度梯度的樣本均準確位于曲線上,體現了良好的線性關系,且相關系數(R2)為0.999,重復性良好。

2.4 特異性實驗結果

對 GoAstV、NDV、(AIV)H1、H5、H9、DHV-1、DHV-3、DTMUV、GPV、DEV、MDPV 進行熒光動力學擴增,結果只有GoAstV 檢測出陽性,其他供試病原均為陰性(圖3)。結果表明該方法具有良好的特異性。

圖2 GoAstV 熒光定量PCR 標準曲線Figure 2 The standard curve of GoAstV Real-time PCR

注:1:GoAstV;2-11: NDV、H9、H1、H5、DHV-1、DHV-3、DTMUV、MDPV、GPV、DEV;12:陰性對照。圖3 TaqMan 熒光定量PCR 特異性實驗結果Note.1, GoAstV.2-11, NDV/H9/H1/H5/DHV-1/DHV-3/DTMUV/MDPV/GPV/DEV.12, Negative control.Figure 3 Results of specific test of TaqMan real-time PCR

2.5 敏感性實驗結果

對于敏感性實驗,將構建的標準質粒進行10 倍梯度稀釋(每微升1.50×109拷貝至1.50×102拷貝)用作熒光動力學檢測的模板,并以CT<35 的情況下呈現標準擴增曲線作為判定該方法的靈敏度的依據。如圖4 所示,該方法的檢出限低至每微升1.5×102拷貝。

2.6 重復性實驗結果

選取3 個稀釋度的標準質粒樣品(1.50×104copies /μL、1.50×106copies /μL、1.50×108copies /μL)分別進行批內和批間的重復性實驗。根據反應結果中CT 值分別計算平均值、標準差及變異系數。結果如表2 可知批內實驗變異系數小于0.5%,批間試驗變異系數均小于4%,證明該方法的重復性良好且具有較高的可靠性。

2.7 臨床樣品的檢測結果

本實驗以常規RT-PCR,TaqMan 熒光定量PCR兩種方法對該50 份疑似發病雛鵝的肛拭子進行檢測,分析結果使用熒光定量PCR 檢出所有樣品均為GoAstV 陽性(50/50),而 RT-PCR 方法的 GoAstV 陽性率為84%(42/50),兩者陽性符合率和吻合度達84%,再次證明該方法較RT-PCR 方法靈敏度更高。

3 討論

GoAstV 由我國科學家于2017 年首次報道,此后該病毒引發的雛鵝內臟痛風病在我國東部省份廣泛流行,是近幾年嚴重危害養鵝業的重要疾病。目前常用RT-PCR 檢測。然而,該方法靈敏度不高且需要凝膠電泳,不適合大量臨床樣本的快速檢測。此外RT-PCR 檢測只能做定性分析,不能準確定量。隨著分子生物學檢測技術的發展,SYBR Green I 實時熒光定量PCR 方法和TaqMan 探針熒光定量PCR 方法相繼出現。近年來,先后有研究者選取GoAstV ORF1b 的RdRp 基因構建了GoAstV 熒光定量PCR 檢測方法[17,22-23],臨床應用證實,其方法能快速、有效地檢測GoAstV,但SYBR Green I 熒光定量PCR 方法只能做到相對定量,TaqMan 探針法則可以做到病毒載量的絕對定量,且TaqMan 探針在引物特異的基礎上再次提高了檢測的特異性[24]。

本實驗室在此基礎上也建立了針對GoAstV ORF1a 基因保守區域的GoAstV 高靈敏度強特異性的TaqMan 探針熒光定量PCR 檢測平臺,并將該方法初步應用于臨床樣品。首先通過對反應條件的優化,最終確立了該方法的最佳反應條件。其次,構建相應的標準質粒,并以梯度稀釋的質粒標準品為模板進行絕對定量擴增反應,結合CT 值和初始模板量成功繪制橫縱坐標相關性良好的標準曲線。以此為基礎進行一系列實驗驗證該方法的特異性、靈敏性和穩定性。特異性實驗結果顯示,除GoAstV出現標準的S 型擴增曲線外,其他水禽病毒均未發現明顯信號的特異性擴增。敏感性試驗結果顯示,CT 值與標準質粒在每微升1.50×109拷貝至1.50×102拷貝之間呈良好的線性關系,102copies/μL 為熒光定量PCR 檢測方法的最小檢測模板濃度為。此方法批內及批間實驗結果重復性均比較好,其中批內試驗變異系數小于0.5%,較前人建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量 PCR 方法穩定性更高。本方法為GoAstV 檢測提供了更多的選擇,為后期病毒在宿主體內定植規律的研究和流行病學調查研究提供了技術支撐。

注:1-8:每微升1.50×109拷貝至1.50×102 拷貝;9:陰性對照。圖4 熒光定量PCR 敏感性實驗Note.1-8, 1.50×109 copies/μL to 1.50×102 copies/μL.9, Negative control.Figure 4 Sensitive test of fluorescence quantitative PCR

表2 批內和批間重復性實驗結果Table 2 Test results of intra-group and inter-group repeatability