西咪替丁對壞死性小腸結腸炎新生大鼠CaMKIV/CREM 通路及腸上皮完整性的影響

孫子梅林曉燕蘇 琴畢勝利

(河北北方學院附屬第二醫(yī)院兒科,河北張家口 075100)

壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)屬新生兒最常見亦是最嚴重的胃腸急癥,起病急、病情重且預后差[1];其中腸道黏膜屏障受損導致腸上皮完整性遭到破壞,嚴重的氧化應激狀態(tài)可增加腸黏膜通透性,引起炎癥失衡、免疫紊亂、炎癥水腫等,造成多器官衰竭[2],危害嚴重。因此,恢復腸上皮完整性對于緩解疾病至關重要。西咪替丁作為臨床上治療NEC 藥物,可降低胃腸道酸度、維持腸道內環(huán)境,從而治療NEC[3],對于改善腸黏膜具有極好療效,但具體機制尚不明確。鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IV(CaMKIV)作為免疫調控因子,其激活可促進促炎細胞因子的表達和加重結腸炎的組織學特征[4];環(huán)磷酸腺苷反應元件調節(jié)蛋白(cyclic AMP response element modulator, CREM)作為CaMKIV 下游基因,在真核生物細胞核中普遍存在,與細胞生長、發(fā)育、分泌等多因素相關[5]。推測西咪替丁通過CaMKIV/CREM 通路緩解腸黏膜屏障。因此,建立 NEC 新生大鼠模型,西咪替丁、CaMKIV 抑制劑KN62 分別處理 NEC 新生大鼠,觀察二者對NEC 新生大鼠的影響,從而初步探討西咪替丁對NEC 新生大鼠的保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5 只健康SD 孕鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)-2017-0033], 大鼠于我院進行適應性飼養(yǎng)[SYXK(京)-2018-0009],清潔級,自然分娩,同日出生體重>5 g 新生大鼠32 只為研究對象,雌雄不限。在溫度(24±1)℃、12 h 光照/12 h 黑暗、通風良好的環(huán)境中自由飲水攝食,所有實驗均經本院動物實驗倫理委員會批準(18020052),每組8 只大鼠即可滿足實驗要求,且最大限度利用實驗動物,即對同一動物采血、取腸組織實驗,實驗滿足3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

西咪替丁注射液(上海第一制藥廠,批號:1-1229-81,規(guī)格:0.2 g/2 mL);CaMKIV 抑制劑KN62(美國Sigma 公司,批號:S742201);異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-Dextran,FITCDextran)40×103(美國 Chondrex 公司,貨號:4009);蘇木素-伊紅(hematoxylin-easine, HE)染色試劑盒(武漢百浩天生物科技有限公司,貨號:C0490);大鼠血小板活化因子(Platelet-activating factor, PAF)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,貨號:F16500);大鼠腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA 試劑盒,一抗兔抗 CaMKIV、CREM、GAPDH(英國 abcam 公司,貨號分別為:ab100785、ab3557、ab5803、ab181602)。缺氧箱(青島艾普智能儀器有限公司,型號:XBS-08B);熒光分光光度計(北京吉天儀器有限公司,型號:Kylin S18);蛋白凝膠成像系統(tǒng)(上海Tanon 公司,型號:2500)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模

實驗分為對照組、模型組、西咪替丁組和CaMKIV抑制劑組,每組8 只。代乳參考文獻[6]報道配制,所有新生大鼠口插管灌胃代乳,首次灌胃0.1 mL,4 h 灌胃一次,隔天增加0.1 mL,最大不超過0.3 mL。

除對照組外其余各組參考文獻[7]建立NEC 新生大鼠模型,新出生1 d 大鼠置于純氮氣的缺氧箱中3 min后取出,立即置于100%氧氣濃度的氧艙中3 min,然后立即置于4℃冰箱中刺激10 min,每日早9 點和晚9 點分別缺氧+復氧+冷刺激各一次,連續(xù)3 d。對照組置于保育箱中,溫度 28℃ ～30℃,濕度45%～55%。每日處理后西咪替丁組根據人與大鼠體表面積換算[8]靜脈注射30.5 mg/kg 西咪替丁[9],CaMKIV 抑制劑組插管灌胃0.72 mg/kg KN62[10],對照組和模型組靜脈注射和灌胃生理鹽水,連續(xù)3 d。

1.3.2 觀察大鼠臨床情況

實驗結束禁食12 h,觀察大鼠情況,包括活動量、反應狀況、喂養(yǎng)情況等。

1.3.3 FITC-Dextran 示蹤法檢測腸道通透性

觀察完大鼠臨床情況后經胃灌入20 mg/mL FITC-Dextran(40 mg/kg),4 h 后斷頭取血,血液抗凝,3000 r/min 離心10 min,參考 FITC-Dextran 試劑盒,熒光分光光度計檢測熒光強度,激發(fā)光波長480 nm,發(fā)射長光波520 nm。根據標準曲線計算樣品濃度[11]。

1.3.4 HE 染色觀察腸組織病理學變化

取盲部近端回腸組織,部分置于4%多聚甲醛中固定,部分置于-80℃冰箱保存。腸道經4%多聚甲醛固定24 h,梯度乙醇脫水、二甲苯透明等步驟后包埋切片,經蘇木精染色、伊紅復染后顯微鏡下觀察腸組織形態(tài)。

參考Nadler 等[6]標準進行組織學評分,0 分時腸粘膜絨毛正常;1 分時黏膜下層或固有層出現輕度分離;2 分時黏膜下層或固有層出現中度分離,或黏膜下層和肌層出現水腫;3 分時黏膜下層或固有層出現重度分離,或黏膜下層和肌層出現嚴重水腫;4 分時腸壁全部壞死。組織學評分≥2 時為NEC。

1.3.5 ELISA 檢測大鼠腸組織中 PAF、TNF-α 水平

-80℃冰箱中取部分腸組織,9 倍生理鹽水制成勻漿液,4℃ 3000 r/min 離心20 min,取上清液,嚴格按照大鼠PAF、TNF-α ELISA 試劑盒檢測腸組織中 PAF、TNF-α 水平。

1.3.6 蛋白免疫印跡檢測大鼠腸組織中CaMKIV、CREM 蛋白水平

-80℃冰箱中取部分腸組織,手術剪剪碎后每管加1 mL 蛋白裂解液冰上研磨,冰上裂解20 min,4℃、13000 r/min 離心20 min,上清液即為腸組織總蛋白。凝膠電泳分離蛋白質,PVDF 膜280 mA、60 min 轉膜,5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h,加入一抗CaMKIV、CREM、GAPDH 4℃孵育過夜,加入二抗室溫孵育1 h。蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,非正態(tài)分布計量數據以中位數(四分位間距)表示,多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗,組間進一步兩兩比較采用Nemenyi 檢驗;正態(tài)分布計量數據均用平均數±標準差(±s)表示,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q法。P<0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 西咪替丁對大鼠臨床癥狀的影響

對照組活動正常,飼養(yǎng)正常,進食排便均正常,大便成形;模型組出現活動減少、反應遲鈍現象,喂養(yǎng)時出現不耐受現象,大便形狀改變;西咪替丁組和CaMKIV 抑制劑組較模型組活動量有所增加,但仍有反應遲鈍現象,喂養(yǎng)狀態(tài)緩和。

2.2 西咪替丁對大鼠腸道通透性影響

與對照組相比,模型組腸道FITC-Dextran 水平升高(P<0.05);與模型組相比,西咪替丁組、CaMKIV 抑制劑組腸道FITC-Dextran 水平降低(P<0.05)。(見表1)

2.3 西咪替丁對大鼠腸組織形態(tài)學影響

對照組大鼠腸壁色澤紅潤、富有彈性,顯微鏡下絨毛完整、排列整齊,腸壁結構正常;模型組腸壁充氣擴張、彈性差,部分出現穿孔現象,顯微鏡下觀察到黏膜下層或固有層分離嚴重,絨毛脫落、腺體紊亂;西咪替丁組和CaMKIV 抑制劑組腸壁充氣擴張,但不嚴重,顯微鏡下觀察黏膜下層或固有層部分分離,出現部分絨毛脫落現象。(圖1)

表1 4 組大鼠腸道FITC-Dextran 水平比較( ±s,n=8)Table 1 Comparison of intestinal FITC-Dextran levels in 4 groups of rats

表1 4 組大鼠腸道FITC-Dextran 水平比較( ±s,n=8)Table 1 Comparison of intestinal FITC-Dextran levels in 4 groups of rats

注:與對照組相比,#P<0.05;與模型組相比,?P<0.05。Note.Compared with the control group, #P<0.05.Compared with the model group, ?P<0.05.

組別Groups FITC-Dextran(mg/L)對照組Control group 49.89±4.18模型組Model group 162.18±18.47#西咪替丁組Cimetidine group 86.18±8.95?CaMKIV 抑制劑組CaMKIV inhibitor group 93.17±9.17?F 134.589 P 0.000

與對照組相比,模型組大鼠腸組織組織學評分升高(P<0.05);與模型組相比,西咪替丁組、CaMKIV 抑制劑組大鼠腸組織組織學評分降低(P<0.05)。(表2)

2.4 西咪替丁對大鼠腸組織中PAF、TNF-α 水平的影響

與對照組相比,模型組腸組織中PAF、TNF-α 水平升高(P<0.05);與模型組相比,西咪替丁組、CaMKIV 抑制劑組腸組織中 PAF、TNF-α 水平降低(P<0.05)。(見表3)

2.5 西咪替丁對大鼠腸組織中CaMKIV、CREM蛋白水平的影響

與對照組相比,模型組腸組織中CaMKIV、CREM 蛋白水平升高(P<0.05);與模型組相比,西咪替丁組、 CaMKIV 抑制劑組腸組織中CaMKIV、CREM 蛋白水平降低(P<0.05)。(見圖2、表4)

注:A:對照組;B:模型組;C:西咪替丁組;D:CaMKIV 抑制劑組。圖1 4 組大鼠腸組織形態(tài)學變化Note.A, Control group.B, Model group.C, Cimetidine group.D, CaMKIV inhibitor group.Figure 1 Morphological changes of intestinal tissue in 4 groups of rats

表2 4 組大鼠腸組織組織學評分比較( ±s,n=8)Table 2 Comparison of intestinal histology scores of 4 groups of rats

表2 4 組大鼠腸組織組織學評分比較( ±s,n=8)Table 2 Comparison of intestinal histology scores of 4 groups of rats

注:與對照組相比,#P<0.05;與模型組相比,?P<0.05。Note.Compared with the control group, #P<0.05.Compared with the model group, ?P<0.05.

組別Groups病理評分[M(P25-P75)]Pathology score對照組Control group 0.00(0.00-1.00)模型組Model group 3.00(3.00-4.00)#西咪替丁組Cimetidine group 1.50(1.00-2.00)?CaMKIV 抑制劑組CaMKIV inhibitor group 1.50(1.00-2.00)?H 24.158 P 0.000

表3 4 組大鼠腸組織中 PAF、TNF-α 水平比較( ±s,n=8)Table 3 Comparison of PAF and TNF-α levels in intestinal tissues of 4 groups of rats

表3 4 組大鼠腸組織中 PAF、TNF-α 水平比較( ±s,n=8)Table 3 Comparison of PAF and TNF-α levels in intestinal tissues of 4 groups of rats

注:與對照組相比,#P<0.05;與模型組相比,?P<0.05。Note.Compared with the control group, #P<0.05.Compared with the model group, ?P<0.05.

組別Groups PAF(mg/L) TNF-α(ng/L)對照組Control group 17.34±1.64 193.48±20.15模型組Model group 35.48±2.49# 476.24±24.11#西咪替丁組Cimetidine group 21.47±1.95? 301.17±21.06?CaMKIV 抑制劑組CaMKIV inhibitor group 23.44±2.03? 314.14±14.28?F 115.537 266.222 P 0.000 0.000

注:A:對照組;B:模型組;C:西咪替丁組;D:CaMKIV 抑制劑組。圖2 4 組大鼠腸組織中CaMKIV、CREM 蛋白表達情況Note.A, Control group.B, Model group.C, Cimetidine group.D,CaMKIV inhibitor group.Figure 2 Expression of CaMKIV and CREM protein in intestinal tissues of 4 groups of rats

表4 4 組大鼠腸組織中CaMKIV、CREM 蛋白水平比較( ±s,n=8 )Table 4 Comparison of CaMKIV and CREM protein levels in intestinal tissues of 4 groups of rats

表4 4 組大鼠腸組織中CaMKIV、CREM 蛋白水平比較( ±s,n=8 )Table 4 Comparison of CaMKIV and CREM protein levels in intestinal tissues of 4 groups of rats

注:與對照組相比,#P<0.05;與模型組相比,?P<0.05。Note.Compared with the control group, #P<0.05.Compared with the model group, ?P<0.05.

組別Groups CaMKIV CREM對照組Control group 0.09±0.01 0.14±0.02模型組Model group 0.78±0.11# 0.39±0.04#西咪替丁組Cimetidine group 0.27±0.04? 0.07±0.01?CaMKIV 抑制劑組CaMKIV inhibitor group 0.12±0.02? 0.11±0.02?F 230.535 267.413 P 0.000 0.000

3 討論

NEC 腸黏膜屏障受損可能引起細胞因子分泌異常、腸黏膜出現萎縮、通透性增加、腸道菌群改變等,導致炎癥反復發(fā)作及加重,致使其功能受損,導致病情加重[12]。腸黏膜功能障礙與腸道免疫系統(tǒng)激活有關,腸黏膜免疫細胞誘發(fā)強烈的免疫應答產生大量的炎癥因子,炎癥因子激活通路,引發(fā)腸黏膜炎癥反應;炎癥因子過度釋放不斷積累,可導致毒性作用產生,產生自身免疫反應導致?lián)p傷和腸黏膜滲透性改變,形成惡性循環(huán)[13-14]。在本研究中發(fā)現,模型組新生大鼠活動減少、反應遲鈍,喂養(yǎng)時出現不耐受現象,大便形狀改變;腸壁充氣擴張、彈性差,部分出現穿孔現象,顯微鏡下觀察到黏膜下層或固有層分離嚴重,絨毛脫落、腺體紊亂;腸道FITC-Dextran 水平升高,提示NEC 大鼠從形態(tài)上觀察活動量減少、且出現反應遲鈍現象,飼養(yǎng)出現不耐受現象,腸道出現彈性差、通透性增大現象腸黏膜下層與固有層分離嚴重、絨毛損傷嚴重,不利于營養(yǎng)物質的吸收。西咪替丁可緩解腸黏膜刺激,加速絨毛修復;亦可產生炎癥抑制劑,緩解腸黏膜水腫炎癥現象;亦具有調控免疫功能和抗病毒作用,從而治療NEC[15]。本研究發(fā)現,與模型組相比,西咪替丁組新生大鼠活動量、反應狀態(tài)均有所緩解,雖然腸壁充氣擴張但不嚴重,腸黏膜下層或固有層部分分離緩解,只出現部分絨毛脫落現象,提示西咪替丁可通過改善腸上皮結構緩解新生大鼠狀態(tài),從而實現對NEC 新生大鼠的保護。

PAF 和 TNF-α 是 NEC 中常見炎癥因子,PAF可在炎癥信號如吞噬作用、趨化性等條件下合成,在炎癥反應中作為重要介質,可激活氧自由基釋放、趨化嗜酸性粒細胞、TNF-α 等,引起血管擴張和通透性增加,參與胃腸粘膜損傷炎癥過程,從而造成機體損傷[16];TNF-α 可受多因子刺激,與PAF 有類似的病理生理作用,可激活各類炎癥因子、增加血管通透性、激活巨噬細胞和中性粒細胞釋放大量蛋白酶和氧自由基,亦可刺激PAF 產生[17]。本研究發(fā)現,與對照組相比,模型組腸組織中PAF、TNF-α 水平升高,提示NEC 新生大鼠腸道組織中出現嚴重的炎癥現象,可激活氧自由基釋放、趨化嗜酸性粒細胞等,引起腸組織血管擴張和通透性增加,造成腸黏膜出現炎癥損傷。

CaMKIV 作為鈣離子通道主要成員之一,參與基因轉錄的調控過程,可調控多種生物學功能,包括神經信息傳遞、記憶過程,胚胎形成、發(fā)育過程,細胞增殖、凋亡過程、基因表達過程等,影響廣泛[18],敲低CaMKIV 可選擇性抑制促炎細胞因子、趨化因子的表達,并可消除分化的肌管中干擾素-γ誘導的CREM 的表達[19]。而 CREM 作為多條信號通路交匯點,其水平增高可導致細胞因子如TNF-α的異常表達、抑制細胞生長因子水平,抑制細胞分化、再生、損傷及修復功能,從而增加疾病風險[20]。本研究發(fā)現,與對照組相比,模型組腸組織中CaMKIV、CREM 蛋白水平升高,提示NEC 腸組織中CaMKIV 水平處于高水平狀態(tài),一方面 CaMKIV 可促進炎癥因子PAF、TNF-α 的表達,增加腸道血管通透性、增加腸道巨噬細胞和中性粒細胞的釋放,另一方面可作用于CREM,亦可直接誘導TNF-α 等表達,加重疾病進程。與模型組相比,西咪替丁組、CaMKIV 抑制劑組腸組織中CaMKIV、CREM 蛋白水平降低,提示西咪替丁與CaMKIV 抑制劑功能類似,均可抑制CaMKIV/CREM 通路的表達,從而降低腸黏膜炎癥、腸血管通透性從而緩解疾病。

綜上所述,西咪替丁可能抑制CaMKIV/CREM通路,減輕腸黏膜炎癥反應、改善腸血管通透性,實現對NEC 腸上皮的保護。但西咪替丁成分復雜,亦可能通過別的通路實現對NEC 的保護,是本文進一步研究重點。