紅景天苷調控FoxO1/β-catenin 通路對2 型糖尿病骨質疏松大鼠的保護作用研究

王澤鳳高 強朱 煜趙建林霍光強

(1.新鄉市中心醫院藥學部,河南 新鄉 453000; 2.新鄉醫學院第一附屬醫院藥學部,河南新鄉 453100;3.新鄉市中心醫院內分泌科,河南新鄉 453000; 4.新鄉市市直機關醫院內科,河南新鄉 453000)

2 型糖尿病性骨質疏松(diabetic osteoporosis,DOP)屬全身性骨骼疾病,是糖尿病嚴重時的骨骼并發癥,會導致骨重減少、骨組織微結構改變、骨骼脆性增加[1];發病率、致殘率呈逐年上升趨勢,大大降低患者生活質量,造成沉重的經濟負擔。目前DOP 的治療以控制血糖、抗骨質疏松為主,尋找更為安全有效的DOP 藥物仍是目前治療重點[2]。紅景天苷(Salidroside,SDS)具有抗炎、抗疲勞、抗氧化、抗細胞凋亡、抗骨質疏松和降血糖等功效,但藥理作用機制尚不明確[3]。叉頭框轉錄因子O 亞族1(Forkhead box transcription factor O1,FoxO1)/β-連環蛋白(β-catenin)通路在維持成骨細胞凋亡和氧化應激中發揮作用,抑制FoxO1/β-catenin 通路可影響氧化應激從而促進凋亡基因介導的細胞凋亡、DNA 修復基因生長停滯、促進 DNA 損傷蛋白表達[4]。推測 SDS 可能通過 FoxO1/β-catenin 通路實現對DOP 的保護。因此,本文構建DOP 大鼠模型,探究SDS 對DOP 大鼠的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

41 只12 周齡SPF 級健康雌性SD 大鼠,購自北京維通利華實驗動物科技有限公司[SCXK(京)2019-0004],動物飼養于新鄉醫學院實驗動物中心[SYXK(豫)2019-0016],體重(200±10)g。所有大鼠在溫度(24±1)℃、光照/黑暗(12/12)h、正常飲水飲食IVC 系統下暫養。符合動物倫理學3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

高糖高脂各組分比例:膽酸鈉 0.1%、豬油10%、基礎飼料61.9%、蔗糖20%、蛋黃粉8%;鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)(美國Sigma 公司,批號:S0131);SDS(原料藥,大連美侖生物技術有限公司,純度≥98%,批號:K06437);白藜蘆醇(Resveratrol,Res)(格魯斯生物科技公司,批號:501-36-0);蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒、EDTA 脫鈣液(上海生工生物技術公司,批號:E607318、 E671001); 活 性 氧 ( Reactive oxygen species,ROS)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號分別為:E004-1-1、A020-2-2、A003-1-2、A005-1-2);一抗兔抗 FoxO1、β-catenin、β-actin,二抗羊抗兔IgG(英國Abcam 公司,批號:ab39670、ab32572、ab8227、ab6721)。

血糖儀(上海羅氏制藥有限公司,型號:ACCUCHEK);雙能X 射線密度儀(上海碩舟電子科技有限公司,型號:CB3351MD);光學顯微鏡(德國徠卡公司,型號:DM500);蛋白凝膠成像系統(賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號:iBright CL750)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥處理

33 只大鼠建立DOP 模型,高糖高脂飼養8 周,8 周后禁食12 h 腹腔注射30 mg/kg STZ,第10 周無菌條件下去除卵巢,摘除卵巢72 h 檢測空腹血糖含量,≥16.70 mmol/L 即為 DOP 模型建立成功[5]。33 只大鼠模型成功24 只,成功率72.73%。24 只大鼠隨機分為模型組、SDS 組、FoxO1 激動劑組,每組8只;正常組8 只大鼠常規飼料飼養相同時間。造模成功后第 2 天 SDS 組灌胃 36 mg/(kg·d) SDS[6],FoxO1 激動劑灌胃40 mg/(kg·d) Res[7],灌胃體積均為10 mL/kg,正常組和模型組灌胃等體積的生理鹽水,連續11 周。

1.3.2 樣本采集

血液采集:造模結束和給藥結束均禁食大鼠12 h,一次性注射器腹腔采血,部分置于抗凝管中檢測血糖水平;部分室溫4000 r/min 離心15 min,分離血清,置于-20℃冰箱保存待用。

雙側股骨采集:給藥結束后剝離股骨雙側肌肉和結締組織,取下雙側股骨,左側置于4%多聚甲醛中固定,右側置于-80℃冰箱。

1.3.3 血糖儀檢測空腹血糖水平

血糖儀檢測腹腔血中空腹血糖水平。

1.3.4 HE 檢測大鼠股骨組織形態

股骨組織于4%多聚甲醛中固定24 h 后,放入20 倍體積EDTA 脫鈣液中脫鈣處理,脫鈣組織用大頭針輕刺,大頭針可輕易穿過骨組織,則脫鈣良好。按照HE 染色試劑盒經蘇木精染色、伊紅復染,顯微鏡下觀察股骨組織形態。

1.3.5 雙能X 射線吸收法測定股骨組織骨密度情況

取出股骨組織,室溫放置直至解凍,雙能X 射線密度儀檢測各組股骨密度。

1.3.6 試劑盒檢測血清中ROS、SOD、MDA、GSHPx 水平

分別按照 ROS、SOD、MDA、GSH-Px 試劑盒說明書檢測血清中 ROS、SOD、MDA、GSH-Px 水平。

1.3.7 蛋白免疫印跡檢測股骨組織中FoxO1、βcatenin 蛋白水平

股骨組織立即浸入液氮中,迅速研磨至細粉。按5 g/L 組織加入RIPA 強效裂解液(含蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑),冰上勻漿30 min,4℃離心機15000 r/min 離心20 min,吸取上清即為股骨組織總蛋白。相同蛋白量上樣、凝膠電泳分離,轉至PVDF 膜上,5% 脫脂奶粉封閉;分別加入一抗FoxO1、β-catenin、β-actin(稀釋比均為 1 ∶2000)后4℃孵育過夜;加入對應二抗(1 ∶5000)室溫孵育1 h。凝膠成像系統對條帶進行灰度分析。

1.4 統計學方法

SPSS 25.0 軟件對所有數據進行統計學分析,計量數據均采用平均數±標準差(±s)表示,多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。P<0.05,差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SDS 對大鼠空腹血糖的影響

建模后給藥前,與正常組相比,模型組、SDS 組、FoxO1 激動劑組空腹血糖水平升高(P<0.05)。給藥后,與正常組相比,模型組空腹血糖水平升高(P<0.05);與模型組相比,SDS 組、FoxO1 激動劑組空腹血糖水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 4 組大鼠空腹血糖水平比較( ±s,mmol/L)Table 1 Comparison of fasting blood glucose levels in 4 groups of rats

表1 4 組大鼠空腹血糖水平比較( ±s,mmol/L)Table 1 Comparison of fasting blood glucose levels in 4 groups of rats

注:與正常組相比,#P<0.05;與模型組相比,?P<0.05。Note.Compared with the normal group, #P<0.05.Compared with the model group, ?P<0.05.

組別Groups建模后給藥前After modeling and before administration給藥后After administration正常組Normal group 6.98±0.86 6.96±0.81模型組Model group 19.25±3.21# 20.18±4.15#SDS 組SDS group 19.35±3.18# 14.48±2.18?FoxO1 激動劑組FoxO1 agonist group 19.27±3.14# 15.44±3.11?F 39.088 29.645 P<0.001 <0.001

2.2 SDS 對大鼠股骨組織形態學影響

正常組骨小梁數目和形態正常;模型組骨小梁出現明顯斷裂,破壞嚴重、數量減少;SDS 組骨小梁明顯斷裂,但空隙間隔有所緩解,數量有所增加;FoxO1 激動劑組骨小梁明顯斷裂,間隙稍有所增加,但不明顯。見圖1。

2.3 SDS 對大鼠股骨組織骨密度影響

與正常組相比,模型組股骨組織骨密度降低(P<0.05);與模型組相比,SDS 組、FoxO1 激動劑組股骨組織骨密度升高(P<0.05)。見表2。

2.4 SDS 對大鼠血清中 ROS、SOD、MDA、GSHPx 水平的影響

與正常組相比,模型組血清中ROS、MDA 水平升高(P<0.05),SOD、GSH-Px 水平降低(P<0.05);與模型組相比,SDS 組、FoxO1 激動劑組血清中ROS、MDA 水平降低(P<0.05),SOD、GSH-Px 水平升高(P<0.05)。見表3。

2.5 SDS 對大鼠股骨組織中 FoxO1、β-catenin 蛋白水平的影響

與正常組相比,模型組股骨組織中 FoxO1、βcatenin 蛋白水平降低(P<0.05);與模型組相比,SDS 組、FoxO1 激動劑組股骨組織中 FoxO1、βcatenin 蛋白水平升高(P<0.05)。見圖2、表4。

表2 4 組大鼠股骨組織骨密度比較( ±s)Table 2 Comparison of bone mineral density of femoral tissue in 4 groups of rats

表2 4 組大鼠股骨組織骨密度比較( ±s)Table 2 Comparison of bone mineral density of femoral tissue in 4 groups of rats

注:與正常組相比,#P<0.05;與模型組相比,?P<0.05。Note.Compared with the normal group, #P<0.05.Compared with the model group, ?P<0.05.

組別Groups骨密度(g/cm2)Bone density正常組Normal group 0.29±0.06模型組Model group 0.17±0.01#SDS SDS group 0.24±0.03?FoxO1 激動劑組FoxO1 agonist group 0.22±0.01?F 16.794 P<0.001

表3 4 組大鼠血清中 ROS、SOD、MDA、GSH-Px 水平比較( _x ± s)Table 3 Comparison of ROS, SOD, MDA, GSH-Px levels in serum of 4 groups of rats

注:A:正常組;B:模型組;C:SDS 組;D:FoxO1 激動劑組。圖2 4 組大鼠股骨組織中FoxO1、β-catenin 蛋白表達情況Note.A, normal group.B, model group.C, SDS group.D,FoxO1 agonist group.Figure 2 FoxO1 and β-catenin protein expression in femoral tissues of 4 groups of rats

表4 4 組大鼠股骨組織中FoxO1、β-catenin蛋白水平比較( ±s)Table 4 Comparison of FoxO1 and β-catenin protein levels in femoral tissues of 4 groups of rats

表4 4 組大鼠股骨組織中FoxO1、β-catenin蛋白水平比較( ±s)Table 4 Comparison of FoxO1 and β-catenin protein levels in femoral tissues of 4 groups of rats

注:與正常組相比,#P<0.05;與模型組相比,?P<0.05。Note.Compared with the normal group, #P<0.05.Compared with the model group, ?P<0.05.

組別Groups FoxO1 β-catenin正常組Normal group 0.93±0.11 0.76±0.09模型組Model group 0.24±0.04# 0.15±0.04#SDS 組SDS group 0.53±0.05? 0.39±0.04?FoxO1 激動劑組FoxO1 agonist group 0.58±0.04? 0.37±0.03?F 143.940 167.760 P<0.001 <0.001

3 討論

糖尿病和骨質疏松都為常見代謝類疾病,糖尿病隨著發病時間的延長,血糖長時間異常、胰島素缺乏或不足、降糖藥物使用等影響骨重量和骨質量,導致骨質疏松[8]。研究表明糖尿病患者并發骨質疏松達50%以上,造成致殘率升高[9]。因此治療DOP 對于糖尿性患者意義重大。SDS 是從紅景天中提取的活性成分,屬植物中廣泛存在的酚苷類化合物,具有調節免疫系統、抗氧化、抗衰老作用[10];在應激性高血糖中具有抗氧化應激和保護應激高糖心肌細胞作用[11]。本研究發現,建模后給藥前,與正常組相比,模型組、SDS 組、FoxO1 激動劑組空腹血糖水平升高,說明DOP 模型建立成功。給藥后,與正常組相比,模型組空腹血糖水平升高,股骨組織骨密度降低,骨小梁出現明顯斷裂,破壞嚴重、數量減少,提示長時間處于高血糖狀態可降低骨密度,表現為骨小梁結構破壞、數量減少,骨骼脆性增加。與模型組相比,SDS 組、FoxO1 激動劑組空腹血糖水平降低,股骨組織骨密度升高,骨小梁結構有所緩解,提示SDS 與FoxO1 激動劑功能類似,均可緩解DOP 空腹血糖水平升高現象,從而增加骨密度,實現對DOP 的保護。

正常情況下機體ROS 的產生與消除處于動態平衡中,但當長時間處于高血糖水平時該平衡被打破,機體內產生過多的ROS,抗氧化能力下降,破骨細胞在細胞水平上產生一系列損傷導致大部分細胞的增殖、分化受阻,促進凋亡[12]。SOD 是機體抗氧化功能核心,可清除機體內氧自由基,減少組織損傷;GSH-Px 可催化過氧化氫酶的分解,降低過氧化氫氧化損傷;MDA 反映機體氧化損傷情況[13-15]。本研究發現,與正常組相比,模型組血清中ROS、MDA 水平升高,SOD、GSH-Px 水平降低,提示 DOP中抗氧化與氧化平衡被打破,機體氧化能力增強、抗氧化能力減弱,導致機體處于氧化應激狀態。與模型組相比,SDS 組、FoxO1 激動劑組血清中ROS、MDA 水平降低,SOD、GSH-Px 水平升高,提示 SDS與FoxO1 激動劑功能類似,均可改善 ROS、MDA、SOD、GSH-Px 水平,糾正抗氧化與氧化不平衡狀態,從而減少對機體的損傷。

FoxO1 作為叉頭框轉錄因子之一,幾乎在所有組織中表達,調控生長發育、細胞老化、氧化應激等過程[16],過表達Foxo1 可減弱糖尿病引起的腎近端腎小管細胞間質纖維化、ROS 產生和凋亡增加現象,從而實現對高糖誘導的糖尿病腎病的保護[17]。在SDS 中,增強SIRT1-FoxO1 途徑介導的自噬可預防氧化應激導致的內皮損傷[18]。β-catenin 作為Wnt 信號通路重要蛋白,可維持骨重建,缺失將導致骨病發生[19]。在DOP 中上調FoxO1 轉錄活性增加β-catenin 水平,增強機體抗氧化作用防止骨丟失,從而影響成骨細胞的增殖和分化,實現對DOP 的保護[20]。本研究發現,與正常組相比,模型組股骨組織中FoxO1、β-catenin 蛋白水平降低,提示 DOP 中機體FoxO1 水平降低對β-catenin 作用減弱,導致機體抗氧化與氧化平衡破壞,從而加速骨密度降低,加重疾病。與模型組相比,SDS 組、FoxO1 激動劑組骨組織中FoxO1、β-catenin 蛋白水平升高,提示上調FoxO1 轉錄活性增加β-catenin 水平可增加機體抗氧化作用防止骨丟失,實現對DOP 的保護,且SDS與FoxO1 激動劑功能類似,推測SDS 可能通過激活FoxO1 發揮對DOP 的保護。

綜上所述,SDS 可激活 FoxO1/β-catenin 通路實現對DOP 大鼠氧化應激的改善,從而實現對疾病的緩解。但FoxO1 下游通路復雜,亦可能通過其他下游通路實現對DOP 的保護,尋找新的下游通路蛋白是下一步研究的重點。