跑臺運動對腦卒中后抑郁大鼠抑郁樣行為、海馬氧化應激及海馬CA1 區BDNF 表達的影響

焦健華高珊珊

(廣東理工學院體育系, 廣東肇慶 526100)

腦卒中后抑郁癥(post stroke depression, PSD)是指腦卒中后出現的以抑郁癥狀如興趣喪失、快感缺乏、思維遲緩、情緒低落,甚至有自殺傾向的心境障礙性精神疾病,是腦卒中后常見的并發癥之一,發病率占腦卒中患者的40%[1]。Kasahara 等[2]研究認為與單純腦卒中患者比較,腦卒中后抑郁癥患者可出現認知功能障礙、抑郁、沮喪或焦慮等癥狀,嚴重危害患者的生存質量使其神經功能的康復延緩,并且腦卒中后抑郁患者死亡的可能性要高出3.4 倍,因此PSD 的預防和治療成為一個重要的研究領域。

越來越多的研究表明,自由基產生與抗自由基之間的不平衡和機體的抗氧化能力下降,可能是導致神經和精神疾病的病理學基礎[3],然而腦氧化應激是否與腦卒中后抑郁行為有關,相關報道較少。海馬是邊緣系統學習記憶的關鍵部位,海馬CA1 區即是缺血損傷的敏感腦區,也是應激反應的主要靶器官,既介導應激的神經內分泌反應,又參與情感反應等精神活動[4]。腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)屬于神經營養因子家族成員,廣泛分布在海馬、紋狀體、皮層和杏仁核等部位,對中樞神經系統多種神經元的分化、增殖和成熟具有促進作用。近來研究認為,BDNF 在調節抑郁癥等神經系統疾病的發病機制中發揮重要作用,與抑郁及焦慮等行為有關[5]。因此,BDNF可能在PSD 治療中發揮關鍵作用。

臨床研究發現,規律的運動鍛煉可促進腦卒中后抑郁癥患者的康復[6]。并且國內學者研究發現,跑臺運動可通過增強前額葉皮質抗氧化能力改善睡眠剝奪大鼠抑郁樣行為[7]。然而運動鍛煉能否通過對抗腦卒中后抑郁癥的海馬氧化應激及調節海馬CA1 區BDNF 的表達改善腦卒中后抑郁大鼠的行為學變化還有待探討,因此本實驗采用大腦中動脈栓塞術( middle cerebral artery occlusion,MCAO) 聯合慢性不可預知性應激( chronic unpredictable mild stress, CUMS)建立大鼠 PSD 模型,觀察長期跑臺運動對PSD 大鼠行為學的影響以及確定這些影響是否與海馬氧化應激水平及海馬CA1 區BDNF 的變化有關,從分子學角度探討PSD的發病機制,以期為臨床治療腦卒中后抑郁提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

3 月齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 44 只,體重 230 ～250 g,由華南農業大學實驗動物中心提供并飼養[SCXK(粵)2019-0048][SYXK(粵)2019-0136],大鼠飼養環境(12 h 晝:12 h 夜;室溫(22±2)℃),整個實驗過程中大鼠自由攝食和飲水(MCAO 術前禁食,慢性應激程序實施過程中禁水、禁食除外)。本研究中涉及動物的使用及操作按3R 原則給與動物人道關懷,并經學校實驗動物管理倫理委員會批準(IACUC:20180925008)。

1.2 主要試劑與儀器

SOD、MDA 及CAT 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;兔抗BDNF 多克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG、SABC 及DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司;恒溫培養箱(BPX52 型,常州諾基儀器有限公司產品);CX31 型光學顯微鏡(日本Olympus 公司);JD- 801 型形態學圖像分析軟件(江蘇省捷達科技發展有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

大鼠購回后適應環境1 周后將44 只大鼠隨機分為4 組:假手術組(sham,n=11)、卒中組(MCAO,middle cerebral artery occlusion,n=11)、PSD 組(大腦中動脈栓塞+慢性應激MCAO rats treated with CUMS,n=11)、PSD 運動組(PSD+E,PSD rats treated with exercise,n=11)。

1.3.2 大腦中動脈栓塞術

參照Kuts 等[8]方法頸內動脈線栓法制備大鼠MCAO 模型,腹腔注射(10%、350 mg/kg)麻醉大鼠后,大鼠頸部正中切開,鑷子鈍性分離頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA),雙重絲線結扎右側ECA 遠心端,在距ICA 分叉近心端0.8～1.0 cm 處斜剪一切口,將經多聚賴氨酸預先處理過的尼龍線圓鈍端(直徑0.26～0.28 mm)沿切口插入近心端,將尼龍線沿右側ICA 走向緩慢推進18 ～20 mm 左右,直至尼龍線頂端有輕微阻力。隨后,用雙重絲線將尼龍線連同CCA 一同結扎,檢查無活動性出血后逐層縫合。為了抗感染,每天給MCAO 術大鼠腹腔注射4 萬單位青霉素以抗感染,連續注射3 d。

按照Longa 分級標準進行神經功能測定及評分,MCAO 術后24 h,出現大鼠不能完全伸展左側前爪,提尾爬行時向對側劃圈,且神經功能評分大于1分,提示卒中大鼠模型制備成功。

1.3.3 卒中后抑郁模型(PSD)制備

在卒中模型制備成功飼養1 周后,給予大鼠CUMS[9]制備卒中后抑郁模型。應激刺激共7 種,包括 24 h 禁食、24 h 禁水、晝夜顛倒、5 min 4℃冷水強迫游泳、2 h 束縛應激、5 min 懸尾及20 min 電擊足底,每天一種,每周應激順序隨機安排,同種刺激不連續出現,連續4 周。

1.3.4 跑臺運動訓練方案[10]

① MCAO 術后1 周,PSD 組及PSD 運動組大鼠接受4 周 CUMS 應激刺激;② PSD 運動組大鼠跑臺訓練前進行3 d 適應性訓練,正式訓練時,每天下午進行跑臺運動,大鼠0 坡度跑臺運動4 周,每周5 d、每天30 min,連續運動4 周。跑臺運動速度:第1 天5 m/min,第2 天8 m/min,第3 天及以后12 m/min。為避免對大鼠造成不良應激,跑臺運動時不使用電擊裝置驅趕大鼠,PSD 運動組大鼠跑臺鍛煉同時每天上午接受1 次CUMS 程序,為期4 周;③ 卒中組及假手術組大鼠在整個實驗過程中不做任何干擾。

1.3.5 行為學測試

(1) 糖水偏愛實驗(sucrose preference test,SPT)

參照Zeldetz 等[11]的方法,單籠飼養大鼠,兩個相同的水瓶同時放置在籠中。測試的第1 天,兩瓶均裝有1%的蔗糖水,24 h 以后,一個瓶內裝純水,另一個瓶裝l%的蔗糖水。大鼠被禁食禁水23 h后,進行 SPT 實驗,給予大鼠相同體積的兩瓶水:一瓶1%的蔗糖水,一瓶純水。1 h 后,取走兩水瓶并測量消耗水量,計算糖水偏愛率 [糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%]評估大鼠的興趣水平。

(2)強迫游泳實驗(forced swimming test, FST)

FST 用于評估大鼠的絕望狀態。測試時,大鼠被單獨放在一個透明的塑料圓筒內(高50 cm,直徑20 cm)水深 35 cm,水溫(25±1)℃。大鼠強迫游泳6 min,兩位觀察者用秒表記錄后4 min 內大鼠在水中的累積不動時間(判斷標準:大鼠停止掙扎或呈漂浮狀態,四肢動作輕微以保持大鼠頭部在水面)。

1.3.6 海馬自由基(SOD、CAT、MDA)測試

行為測試結束即刻稱重后,大鼠經3% 戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔注射麻醉后斷頭處死,打開顱腔將腦組織取出,迅速于冰盤上分離海馬,加入4℃生理鹽水用玻璃勻漿器制成10% 的海馬組織勻漿,離心(轉速4000 r/min,時間10 min),取上清液按試劑盒(由南京建成生物工程研究所提供)說明書測定海馬超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量。

1.3.7 海馬CA1 區BDNF 取材與切片

大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)深度麻醉,打開胸腔,用4% 多聚甲醛150 mL 常規心臟灌注,開顱取出腦組織,30% 蔗糖溶液后固定。經常規的梯度乙醇脫水、二甲苯固定后浸蠟、石蠟包埋制成蠟塊,然后將腦組織連續冠狀切片,片厚5 μm,然后進行BDNF 免疫組織化學染色。將石蠟切片置于68℃烤箱中烘烤20 min,常規二甲苯脫蠟2 次,PBS液每5 分鐘再沖洗2 次,切片入3% 甲醇雙氧水液室溫孵育30 min 消除內源性過氧化物酶的活性,37℃孵育1 h,隨后滴加BDNF 血清第一抗體100 μL(兔抗大鼠,1 ∶50),4℃ 過夜,PBS 液每5 min漂洗 3 次,隨后加入第二抗體50 μL(生物素標記的羊抗兔),37℃ 孵育2 h;接著DAB 室溫顯色15 min,清洗、貼片,常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明,樹膠封片。

1.3.8 圖像分析

照大鼠腦立體定位圖譜隨機選取海馬CA1 區相同區域的5 個視野,olympus 光學顯微鏡拍攝海馬CA1 BDNF 的表達,利用形態學顯微圖像分析系統測量海馬CA1 區BDNF(400 倍)陽性細胞數。

1.4 統計學方法

所測得的結果采用SPSS 18.0 統計軟件包進行統計學分析,各組數據均以平均數±標準差(±s)表示,組間差異均采用單因素方差分析,以P<0.05為具有統計學意義,P<0.01 有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 動物存活情況

實驗共有4 只大鼠死亡。PSD 組及 PSD 運動組各死亡2 只,死亡原因為注射麻醉過量,造模中死亡及造模后疾病(腦部感染、出血)死亡。

2.2 強迫游泳實驗結果

6 min 強迫游泳實驗中,與假手術組比較,卒中組大鼠游泳不動時間顯著延長(P<0.05);與假手術、卒中組大鼠比較,PSD 組大鼠游泳不動時間顯著延長(P<0.01);經過4 周規律跑臺運動,與PSD組比較,PSD 運動組大鼠游泳不動時間顯著縮短(P<0.05),下降幅度為16%。見表1。

2.3 糖水偏愛實驗結果

糖水偏愛實驗中,與假手術組比較,卒中組大鼠糖水攝入量、糖水偏愛百分比及液體總消耗量均無顯著差異(P>0.05);與假手術組、卒中組比較,PSD 組大鼠糖水攝入量及糖水偏愛百分比均顯著減少(P<0.01),液體總消耗量無顯著差異(P>0.05);而經過4 周規律跑臺運動,與PSD 組比較,PSD 運動組大鼠糖水攝入量及糖水偏愛百分均顯著增加(P<0.05,P<0.01),液體總消耗量兩組之間無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.4 海馬自由基水平結果

與假手術組比較,卒中組大鼠海馬組織中SOD及CAT 活性均顯著下降(P<0.05),MDA 含量增加(P<0.05);與假手術組及卒中組比較,PSD 組大鼠海馬組織中SOD 及CAT 活性均明顯減弱,MDA 含量增加(P<0.01,P<0.05);經過4 周規律跑臺運動,與PSD 組大鼠比較,PSD 運動組大鼠海馬SOD及CAT 活性顯著增強,MDA 含量顯著下降(P<0.05)。見表3。

2.5 海馬CA1 區BDNF 表達結果

PSD 組大鼠海馬組織中BDNF 陽性細胞胞漿著色很淺,有的細胞呈空泡狀。與假手術組比較,卒中組大鼠海馬CA1 區BDNF 個數顯著減少(P<0.01);與假手術組及卒中組比較,PSD 組大鼠海馬CA1 區BDNF 個數顯著減少(P<0.01);經過4 周規律跑臺運動,與PSD 組大鼠比較,PSD 運動組大鼠海馬CA1 區BDNF 個數顯著增加(P<0.05)。見表4,圖1。

表1 各組大鼠強迫游泳實驗結果( ±s)Table 1 Results of forced swimming test in various group rats

表1 各組大鼠強迫游泳實驗結果( ±s)Table 1 Results of forced swimming test in various group rats

注:與假手術組比較,ΔΔP<0.05,ΔP<0.05;與卒中組比較,▲▲P<0.01,▲P<0.05;PSD 運動組與 PSD 組比較,#P<0.05。下同。Note.Compared with sham group, ΔΔP<0.05, ΔP<0.05.Compared with MCAO group, ▲▲P<0.01, ▲P<0.05.PSD+E group compared with the PSD group, #P<0.05.The same as below.

分組Groups假手術組(n=11)Sham group卒中組(n=11)MCAO group PSD(n=9)PSD group PSD 運動組(n=9)PSD+exercise group不動時間(s)Immobility time 54.56±8.45 75.56±10.34Δ 114.79±33.45ΔΔ ▲▲ 96.45±15.67ΔΔ ▲#

表2 各組大鼠糖水偏愛實驗結果( ±s)Table 2 Results of sucrose preference test in various group rats

表2 各組大鼠糖水偏愛實驗結果( ±s)Table 2 Results of sucrose preference test in various group rats

分組Groups n 糖水攝入(mL)Sucrose intake糖水偏愛百分比(%)Sucrose preference ratio液體總消耗量(mL)Total intake假手術組Sham group 11 16.98±3.51 78.24±5.98 21.70±5.10卒中組MCAO group 11 14.65±5.34 72.88±3.56 20.10±3.72 PSD 組PSD group 9 8.30±2.31ΔΔ ▲▲ 41.61±7.21ΔΔ ▲▲ 20.43±4.21 PSD 運動組PSD+E group 9 10.89±3.23Δ ▲# 54.78±4.68Δ ▲## 19.81±4.32

表3 各組大鼠海馬組織中SOD、CAT 活性及MDA 含量實驗結果( ±s,n=6)Table 3 Results of SOD and CAT activities and MDA content in hippocampus in various group rats

表3 各組大鼠海馬組織中SOD、CAT 活性及MDA 含量實驗結果( ±s,n=6)Table 3 Results of SOD and CAT activities and MDA content in hippocampus in various group rats

分組Groups超氧化物歧化酶(U/mg)SOD過氧化氫酶(U/mg)CAT丙二醛(nmol/mg)MDA假手術組 Sham group 313.56±38.89 15.35±2.45 5.12±0.89卒中組 MCAO group 278.36±27.65Δ 11.68±1.89Δ 7.98±1.13Δ PSD 組 PSD group 198.45±19.78ΔΔ▲▲ 7.76±0.86ΔΔ▲▲ 11.46±1.98ΔΔ▲PSD 運動組 PSD+E group 248.58±32.65ΔΔ ▲# 8.88±1.24Δ ▲# 8.23±0.88Δ ▲#

表4 各組大鼠海馬CA1 區BDNF 表達結果( ±s)Table 4 Results of hippocampus CA1 BDNF expression in various group rats

表4 各組大鼠海馬CA1 區BDNF 表達結果( ±s)Table 4 Results of hippocampus CA1 BDNF expression in various group rats

分組Groups n 細胞個數Number假手術組 Sham group 5 51.38±10.54卒中組 MCAO group 5 36.48±7.46ΔΔ PSD 組 PSD group 3 25.64±5.38ΔΔ ▲▲PSD 運動組 PSD+E group 3 34.67±9.64ΔΔ ▲#

注:冠狀切面顯示大鼠海馬CA1 區BDNF 表達(箭頭所指)。圖1 海馬CA1 區BDNF 免疫組化檢測結果Note.Coronal sections showing the BDNF expression (arrows) in the hippocampus CA1 of the rats.Figure 1 Results of BDNF immumohistochemical staining in hippocampus CA1

3 討論

研究認為,卒中后抑郁和焦慮是常見的臨床表現,實際上,高達40%的中風幸存者會患焦慮及抑郁癥[12]。PSD 大鼠模型的建立不同于單純抑郁動物模型,必須具備與腦卒中相類似的腦血管缺血的病理基礎,同時還要模擬抑郁癥的探索活動減少、行為絕望等臨床表現。本實驗PSD 模型采用大腦中動脈結扎,導致大鼠腦血管缺血的病理改變與臨床腦卒中比較接近,大鼠腦缺血后給予慢性不可預知的溫和應激,較好的模擬了腦卒中后抑郁患者的病理狀態。本實驗結果發現,腦卒中大鼠接受28 d CUMS,糖水偏愛實驗中大鼠糖水攝入量及糖水偏愛百分比均減少,強迫游泳實驗中大鼠掙扎時間延長,提示腦卒中大鼠出現了腦卒中后抑郁癥的核心癥狀快感缺乏及行為絕望。越來越多的證據表明體育鍛煉可有效激活神經元從而防止應激引發的精神疾病的發病率,包括抑郁和焦慮[13]。本研究也證實,經過4 周規律的跑臺運動,PSD 運動組大鼠強迫游泳實驗中掙扎時間延長,不動時間縮短;糖水偏愛實驗中大鼠糖水消耗量和糖水偏愛百分比顯著增加,提示長期跑臺運動可以在一定程度上可改善PSD 大鼠興趣下降的表現,并能對抗PSD 大鼠的絕望及無助行為。

許多研究表明,急、慢性應激會增強大腦區域的氧化應激損傷,導致氧自由基形成,損害細胞蛋白質,引起DNA 損傷誘導脂質過氧化,導致中樞神經系統氧化應激損傷,與抑郁發生有一定的關系[14]。Ozcan 等[15]通過臨床研究發現,與健康人比較,抑郁病人血清SOD 及CAT 活性顯著下降。并且動物實驗證實,CUMS 導致大鼠焦慮及抑郁樣行為與大腦脂質過氧化代謝產物MDA 水平增高有關,因此認為CUMS 對大鼠情緒和行為的有害影響是通過氧化途徑介導的[16]。本研究我們聚焦海馬組織,結果顯示PSD 降低了大鼠海馬組織抗氧化防御機制,具體表現在PSD 大鼠海馬組織SOD 及CAT活性下降,MDA 含量增加,以上海馬組織抗氧化能力下降或許與PSD 大鼠抑郁樣行為有關。考慮到有氧運動可以有效的調節不良情緒,而且研究報道有氧運動可以通過調節氧自由基的活性改善應激大鼠抑郁及焦慮行為[17]。本實驗對PSD 大鼠進行4 周跑臺運動干預,結果發現運動使PSD 大鼠的抗氧化活性酶SOD 及CAT 活性均有一定恢復,MDA含量下降,因此可以認為有氧運動可以通過增強海馬組織抗氧化能力改善PSD 大鼠的興趣下降及絕望無助等抑郁行為。

目前關于卒中患者腦損傷與PSD 發生關系的研究較多,有學者認為腦卒中后海馬CA1 退行性病變導致海馬功能受損,而海馬其他區域如CA3 和齒狀回(DG) 被認為對缺血應激具有抵抗性[18]。BDNF 為神經營養素家族的重要成員,在海馬表達較多,對多種神經元具有促分化、增殖、營養和成熟的作用,是神經可塑性及神經生長的調節因子,且在腦卒中后抑郁癥的發病機理中起重要作用[19]。因此,本研究聚焦海馬CA1 區,結果發現,腦卒中大鼠經過28 d CUMS 海馬CA1 區BDNF 陽性細胞數量明顯低于假手術組及卒中組大鼠,提示BDNF 在腦卒中抑郁的發病中可能發揮了重要作用。Monteggia 等[20]通過強迫游泳及糖水偏愛實驗證實小鼠 BDNF 敲除會增強小鼠的抑郁樣行為,且BDNF 直接注入到中腦或海馬區域會產生類似抗抑郁藥的作用。因此,可以推測PSD 大鼠糖水偏愛實驗中大鼠表現的獎賞反應下降及強迫游泳實驗中表現的悲觀、無助等抑郁行為與海馬BDNF 的表達減弱有關。越來越多的證據表明,體育鍛煉對情緒、壓力反應及與壓力相關的精神疾病,如抑郁癥和焦慮癥有很大的保護作用。Luo 等[21]通過強迫游泳實驗、糖水偏愛實驗及曠場實驗發現,4 周跑臺運動可改善PSD 大鼠抑郁行為。本研究得到相同結果,4 周跑臺運動可增加PSD 大鼠糖水偏愛百分比、強迫游泳實驗中掙扎時間延長,說明跑臺運動可以改善PSD 大鼠的抑郁樣行為。研究認為,抗抑郁藥艾司西酞普蘭對腦缺血大鼠的神經保護作用可能與海馬CA1 區BDNF 增加及氧化應激的降低密切相關[22]。因此可以推測 4 周跑臺運動改善PSD 大鼠的抑郁樣行為可能與此運動增強海馬組織抗氧化能力、上調海馬CA1 區BDNF 表達從而對腦卒中抑郁大鼠起到保護作用有關,具體機制需進一步研究。