QuEChERS-dSPE-UPLC-MS/MS篩查中藥材地龍中41種獸藥殘留

許曉輝，王小喬*，黨子龍，朱仁愿，張虹艷，李晨曦，潘秀麗，李 赟

(1.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，蘭州 730050; 2. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000)

中藥材分為植物源性中藥材和動(dòng)物源性中藥材，動(dòng)物源性中藥材是指動(dòng)物整體、器官、生理或病理產(chǎn)物等供藥用的部分?！吨袊?guó)藥典》2020年版收載了55種動(dòng)物源性中藥材，常見(jiàn)的有麝香、牛黃、地龍、海螵蛸、鹿角等[1-3]。然而，多數(shù)動(dòng)物源性中藥材大多數(shù)是以農(nóng)戶(hù)為單位人工養(yǎng)殖，在養(yǎng)殖過(guò)程中，缺乏對(duì)中藥材外源性風(fēng)險(xiǎn)因子的認(rèn)識(shí)，使用抗菌劑、抗生素和激素等獸藥用于動(dòng)物疾病防治、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和提高飼料轉(zhuǎn)化率。不合理使用獸藥使藥物在動(dòng)物體內(nèi)難以排泄，逐漸積累，患者通過(guò)服用中藥材致使獸藥轉(zhuǎn)移到體內(nèi)，對(duì)人體器官造成危害，嚴(yán)重威脅到身體健康和生命安全。目前，動(dòng)物源性產(chǎn)品獸藥殘留已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)，為保護(hù)公眾健康，大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)對(duì)動(dòng)物源性產(chǎn)品中獸藥殘留進(jìn)行監(jiān)管，并發(fā)布了相關(guān)法規(guī)制度。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)和國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局在2019年聯(lián)合發(fā)布了《GB 31650-2019 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[4]，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的最大限值，但不涉及動(dòng)物源性中藥材；US FDA于2015年6月通過(guò)獸藥飼料指令頒布了管控微生物藥物使用的法規(guī)[5]；歐盟頒布了法規(guī)2014/0247(COD)，旨在達(dá)成影響評(píng)估所確定的目標(biāo)，并解決抗生素耐藥性帶來(lái)的公共健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題[6]。從國(guó)家監(jiān)管部門(mén)對(duì)動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的市場(chǎng)監(jiān)督抽檢結(jié)果來(lái)看，獸藥殘留仍是影響動(dòng)物源性食品質(zhì)量安全的重要風(fēng)險(xiǎn)因子[7]，因此，對(duì)于與動(dòng)物源性食品來(lái)源相似的動(dòng)物源性中藥材，同樣存在獸藥殘留問(wèn)題。近年來(lái)，多類(lèi)別多殘留分析方法因?yàn)榭梢詳U(kuò)大檢測(cè)范圍并提高實(shí)驗(yàn)室效率而在檢測(cè)中越來(lái)越受青睞[8-10]，因此，本文建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定地龍中多類(lèi)別多組分獸藥殘留的方法，根據(jù)化合物質(zhì)譜響應(yīng)、峰型以及加標(biāo)回收率，淘汰不出峰、響應(yīng)低及加標(biāo)回收率不理想的獸藥，最終篩選出適合本方法良好測(cè)定的7大類(lèi)41種獸藥，測(cè)定項(xiàng)目涉及到磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、硝基咪唑類(lèi)、抗病毒類(lèi)、糖皮質(zhì)激素類(lèi)、非甾體抗炎類(lèi)和鎮(zhèn)靜安眠類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 儀器 1290-6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源(美國(guó)安捷倫有限公司)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g(梅特勒)；真空泵(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；移液器：20 μL、100 μL、1 mL(德國(guó)Eppendorf公司)；渦旋混合器(美國(guó)Scientific)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；超聲波清洗器(寧波新芝有限公司)；容量瓶(天玻儀器有限公司)。

1.2 試劑 超純水(美國(guó)Millipore公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)，甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；dSPE EMR-Lipid凈化管(美國(guó)安捷倫公司)；氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。對(duì)照品，恩諾沙星、地美硝唑、磺胺甲惡唑、磺胺氯噠嗪、磺胺喹沙啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、金剛烷胺均購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer GmbH，環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、地塞米松、可的松、曲安奈德、氟米松、甲硝唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧芐啶、保泰松、吲哚美辛、吡羅昔康、氨基比林、三唑侖、硝西泮、勞拉西泮、馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖、阿普唑侖、氯硝西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、地西泮均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，洛硝噠唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑購(gòu)自WITEGA，沙拉沙星、磺胺間甲氧嘧啶均購(gòu)自Bepure，金剛乙胺購(gòu)自TRC，具體信息見(jiàn)表1。供試樣品購(gòu)買(mǎi)于中藥材市場(chǎng)和藥店。

表1 對(duì)照品信息

1.3 溶液制備

1.3.1 EDTA緩沖液制備 檸檬酸8.4 g，磷酸氫二鈉7.1 g，乙二胺四乙酸二鈉 19.5 g，溶于650 mL水中，超聲溶解，即得。

1.3.2 對(duì)照溶液制備 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精密稱(chēng)取41種獸藥殘留對(duì)照品10.0 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解，并定容至刻度，配制成濃度為 1 mg/mL的儲(chǔ)備液，置 4 ℃冷藏備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.025 mL至25 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋?zhuān)⒍ㄈ葜量潭?，配制成濃度?1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，置 4 ℃冷藏備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)使用溶液：準(zhǔn)確移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶，用乙腈稀釋?zhuān)⒍ㄈ葜量潭龋渲瞥蓾舛葹?100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.3.3 陰性樣品溶液的制備 取空白樣品按照“1.4.1供試樣品前處理方法”步驟同法制成空白基質(zhì)樣品溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 供試樣品前處理方法 提取：準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的供試樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入3 mL EDTA緩沖液和陶瓷均質(zhì)子，渦旋1 min，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取5 min，加入1 g 氯化鈉和4 g 硫酸鈉，充分渦旋2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液待凈化。凈化：準(zhǔn)確吸取提取步驟所得上清液2.00 mL于 dSPE EMR-Lipid凈化管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心10 min，取上層清液過(guò)0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，上液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

1.4.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(d-MRM)，霧化氣N2，干燥氣流速8 L/min，噴霧電壓500 V，氣流溫度325 ℃，毛細(xì)管電壓4000V，鞘氣流速12 L/min，鞘氣溫度350 ℃；質(zhì)譜條件見(jiàn)表3。

表3 41種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用 Agilent MassHunter 工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察的獸藥包括親水性和疏水性藥物，酸性、中性和堿性藥物，這些藥物在適宜的濃度大部分能夠在甲醇和乙腈中溶解，另一方面，流動(dòng)相的有機(jī)相一般都是甲醇和乙腈，考慮到乙腈為中等極性溶劑，與大多數(shù)被測(cè)化合物極性接近，且乙腈能使蛋白質(zhì)變性沉淀，因此選擇乙腈作為提取溶劑。QuEChERS萃取鹽包，內(nèi)含 4 g 硫酸鈉和1 g 氯化鈉，通過(guò)鹽析使樣品中蛋白質(zhì)沉淀并能去除極性干擾物。dSPE EMR-Lipid 選擇性去除高脂肪基質(zhì)中主要脂類(lèi)組分，能夠降低基質(zhì)效應(yīng)以增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng)，同時(shí)有助于延長(zhǎng)色譜柱使用壽命，同時(shí)無(wú)需活化、清洗和洗脫等傳統(tǒng)SPE步驟，簡(jiǎn)化了凈化流程，節(jié)約了時(shí)間和成本。因此本實(shí)驗(yàn)選擇使用QuEChERS萃取鹽包提取，dSPE EMR-Lipid 凈化。

2.2 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)被分析的獸藥之間化學(xué)性質(zhì)各異、極性不一，因此，選擇了適用于各種分析物通用的ACQUITY BEH C18超高效色譜柱。正離子模式下，在流動(dòng)相中添加甲酸能夠提高目標(biāo)化合物的離子化效率，添加乙酸銨能夠穩(wěn)定水相和改善峰型，因此試驗(yàn)將乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨、水溶液進(jìn)行組合，考察分離效果和靈敏度，選擇最佳流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，在水相中加入0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸銨可以顯著改善峰型、提高靈敏度，在有機(jī)相中加入0.1%甲酸可以穩(wěn)定保留時(shí)間，提高重復(fù)性。最終本實(shí)驗(yàn)采用含0.1%甲酸-2 mmol乙酸銨的水溶液與含0.1%甲酸的乙腈溶液作為流動(dòng)相。

2.2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 由于被分析獸藥種類(lèi)眾多，采用MRM采集模式，受循環(huán)時(shí)間限，有些獸藥響應(yīng)低，因此，本研究選擇將檢測(cè)獸藥分別配制成單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，直接注入質(zhì)譜儀，在正離子模式下，進(jìn)行Scan掃描，確定母離子，后進(jìn)行SIM掃描，選取豐度比最高且相對(duì)穩(wěn)定的2個(gè)碎片離子分別作為定性離子和定量離子，然后利用MassHunter采集軟件，以手動(dòng)和自動(dòng)兩種方式同時(shí)優(yōu)化定性和定量離子的碰撞能量、裂解電壓等參數(shù)，建立MRM方法，為了建立d-MRM方法，首先在MRM方法下分析混合標(biāo)樣，得到混合標(biāo)樣數(shù)據(jù)文件，將該采集數(shù)據(jù)文件從安捷倫的MassHunter質(zhì)譜采集工作站軟件導(dǎo)入自動(dòng)生成d-MRM方法，生成的d-MRM方法包含化合物名稱(chēng)、MRM離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量、動(dòng)態(tài)MRM的保留時(shí)間和保留時(shí)間增量窗口，對(duì)于軟件不能自動(dòng)識(shí)別保留時(shí)間及保留時(shí)間增量窗口的化合物，在安捷倫定性軟件通過(guò)提取化合物的離子對(duì)手動(dòng)識(shí)別。

2.3 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)是基質(zhì)中除目標(biāo)物以外的其他成分對(duì)目標(biāo)物分析的影響。由于其成分與目標(biāo)組分在離子化過(guò)程中存在競(jìng)爭(zhēng)，改變了目標(biāo)物的電離效率，使目標(biāo)物的離子響應(yīng)強(qiáng)度降低或增強(qiáng)，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文通過(guò)考察空白樣品基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)強(qiáng)度與純?nèi)軇┲邢嗤瑵舛葮?biāo)準(zhǔn)溶液信號(hào)強(qiáng)度的比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，大部分獸藥存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，其中氨基比林、保泰松、羥基甲硝唑、氯硝西泮、諾氟沙星、洛美沙星、硝西泮存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)比較弱，而濃度為200 ng/mL的四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素樣品基質(zhì)溶液在質(zhì)譜上幾乎沒(méi)有響應(yīng)。

2.4 41種獸藥的總離子流圖 以d-MRM 模式測(cè)定41種獸藥的定性和定量離子對(duì)色譜圖，共有82個(gè)離子監(jiān)測(cè)通道。圖1是濃度為30 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖，各個(gè)化合物峰形對(duì)稱(chēng)，響應(yīng)良好，定量準(zhǔn)確可靠。

圖1 41種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品MRM總離子流圖

2.5 線性關(guān)系、檢出限、定量限 取混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液用空白樣品基質(zhì)溶液稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)溶液，外標(biāo)法定量，以X軸為濃度，Y軸為峰面積的響應(yīng)值，得到各個(gè)獸藥的線性回歸方程，用于計(jì)算實(shí)際樣品中待測(cè)物的濃度。取陰性樣品，混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液通過(guò)最小添加量，按“1.4.1”項(xiàng)下供試樣品前處理方法同法處理后上機(jī)進(jìn)樣測(cè)試，以3 倍信噪比計(jì)算各個(gè)被分析獸藥的檢出限(LOD)，以10倍信噪比計(jì)算各個(gè)被分析獸藥的定量限(LOQ)。41種獸藥的線性關(guān)系、檢出限、定量限見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，41種獸藥在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.9917)，檢出限范圍為0.1000～3.105 μg/kg，定量限范圍為0.3148～7.532 μg/kg。

表4 41種獸藥的線性關(guān)系、檢出限、定量限、回收率及精密度(n=3)

2.6 回收率及精密度考察 在空白地龍樣品中分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，低、中、高3個(gè)加標(biāo)量分別為30.0、80.0、200.0 μg/kg，每個(gè)添加水平平行制備3份樣，每份樣重復(fù)測(cè)定3次，經(jīng)提取凈化后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，41種獸藥的回收率為62.8% ～ 112.3%，精密度為1.1% ～ 8.9%。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度良好，符合定量檢測(cè)要求。

2.7 樣品的測(cè)定 為驗(yàn)證方法的可行性，將市售的10批地龍樣品作為測(cè)試樣品，應(yīng)用該方法測(cè)定樣品中7大類(lèi)41種獸藥殘留，均未檢出上述被分析目標(biāo)化合物。

3 討論與結(jié)論

動(dòng)物源性中藥材富含蛋白質(zhì)和脂肪，測(cè)定獸藥殘留時(shí)，蛋白質(zhì)和脂肪去除不干凈或不徹底會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，甚至?xí)氯V柱，因此，前處理方法的選擇是此類(lèi)樣品測(cè)試的關(guān)鍵。同時(shí)，動(dòng)物在養(yǎng)殖整個(gè)生命周期中，不僅是動(dòng)物出現(xiàn)病患違規(guī)使用獸藥，而是將獸藥作為動(dòng)物產(chǎn)品違法獲取經(jīng)濟(jì)利益的促進(jìn)劑，使用獸藥時(shí)多是一種藥物產(chǎn)生耐藥性后，便換成另一種，甚至多種藥物同時(shí)使用，因此，獸藥殘留檢測(cè)只測(cè)定一類(lèi)藥物有可能漏檢，達(dá)不到全面評(píng)價(jià)動(dòng)物源性中藥質(zhì)量安全的目的。目前， 一針進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定多獸藥殘留是當(dāng)前一個(gè)研究熱點(diǎn)，這樣可以節(jié)約成本、提高效率。本文采用QuEChERS、dSPE相結(jié)合的提取凈化方法，建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定中藥材地龍中7大類(lèi)41種獸藥殘留的方法。以?xún)x器方法為基礎(chǔ)，結(jié)合地龍樣品基質(zhì)的特點(diǎn)，從提取方法、凈化技術(shù)、色譜質(zhì)譜條件等多個(gè)方面進(jìn)行研究和優(yōu)化，對(duì)建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明，該方法各項(xiàng)指標(biāo)均能滿(mǎn)足分析檢測(cè)的要求，與目前報(bào)道的文獻(xiàn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，該方法簡(jiǎn)化了復(fù)雜的前處理，實(shí)現(xiàn)了多類(lèi)別多組分獸藥殘留同時(shí)測(cè)定，提高了檢測(cè)效率，對(duì)動(dòng)物源性中藥材中多類(lèi)別多組分獸藥殘留分析監(jiān)測(cè)、快速篩查具有參考意義。