基于pH調節的CMCS-PMMS/PAAm復合水凝膠的構筑與性能研究

劉瑞雪 李迎博 陳紀超

摘要：以聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸/二氧化硅（Poly（MMA/MAA）/SiO2，PMMS）、羧甲基殼聚糖（CMCS）、丙烯酰胺（AAm）為原料，EDC/NHS為催化劑，通過調節體系pH值和自由基聚合反應制備了系列CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠，并對其流變性能、力學性能、溶脹性能、導電性能及生物相容性進行研究.結果表明：pH值對復合水凝膠的流變性能具有較大影響，儲能模量G′整體呈先減小后增大的趨勢，當pH值為6時，G′最大為9200 Pa;在較低pH值條件下制備的復合水凝膠強度較大，較高pH值條件下則呈現軟而韌的性質，且當pH值為9或10時，復合水凝膠能在較大壓縮應變下保持良好的形態并擁有較好的拉伸性能和可循環壓縮性能;該復合水凝膠具有良好的溶脹性能，即使在吸水達到溶脹平衡后，仍能保持形變恢復能力（純水中平衡溶脹率可達860%）;另外，它還具有良好的導電性能，其電導率最大可達2.98×10-4 S/cm，且具有良好的抗溶血性能與細胞相容性，所有復合水凝膠樣品的溶血率均小于5%，細胞活性均在75%以上.

Abstract：polymethyl methacrylate|methacrylic acid/silica （Poly（MMA/MAA）/SiO2，that is，PMMS），carboxymethyl chitosan （CMCS），acrylamide （AAm） were used as raw materials，EDC/NHS as catalysis，the CMCS|PMMS/PAAm composite hydrogel was prepared by pH adjustment，free radical polymerization.The rheological properties，mechanical properties，swelling properties，electrical conductivity and biocompatibility of the hydrogels were studied.The results showed that the pH value had a great influence on the rheological properties of the composite hydrogel.The storage modulus （G′） decreased first and then increased.When the pH value was 6，the G′ maximum was 9200 Pa; Hydrogels with low pH were stiff，and the ones with high pH were soft and tough.When the pH value was 9 or 10，the composite hydrogel could maintain a good shape under a large compressive strain. It had good tensile properties and cyclic compressibility.The composite hydrogel also had good swelling properties，and even after water absorption reached the swelling equilibrium，it could still maintain the deformation recovery ability （the equilibrium swelling rate in pure water could reach 860%）.In addition，the hydrogel had good conductivity，the highest conductivity could reach 2.98×10-4 S/cm; and it had good anti|hemolysis performance and cell compatibility.The hemolysis rate of all composite hydrogel samples was less than 5%，and the cytoactive was more than 75%.

關鍵詞：pH值;CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠;流變性能;力學性能;溶脹性能;導電性能;生物相容性

Key words：pH value;CMCS|PMMS/PAAm composite hydrogel;rheological property;mechanical property;swelling property;electrical conductivity;biocompatibility

中圖分類號：TB324

文獻標識碼：A文章編號：2096-1553（2021）02-0064-10

0 引言

羧甲基殼聚糖（CMCS）是殼聚糖經羧基化后形成的一種多糖[1-2]，側鏈上易電離的羧基增大了其在水中的溶解能力，且在溶解過程中不受pH值的限制.這既保留了CMCS自身良好的生物相容性，也增加了其溶解性，在高pH值條件下自身不會發生凝膠化反應，因此被廣泛應用于生物醫學、生物技術等領域[3-4].

天然高分子魔芋葡甘聚糖[5]、明膠[6]、殼聚糖（如CMCS）等常被用作基礎原料合成水凝膠.傳統的CMCS水凝膠通常采用戊二醛進行交聯反應制得[7-8]，如E.Y.Yan等[9]以戊二醛為交聯劑，制備了一種具有有效孔洞結構的CMCS水凝膠.但由于戊二醛具有一定的毒性，且該類水凝膠強度較小，這在一定程度上限制了CMCS水凝膠的應用.采用生物毒性較小的交聯劑制備水凝膠成為近年來的研究趨勢.朱壽進等[10]采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS）交聯體系，制備了一種羧甲基殼聚糖自交聯水凝膠;劉水蓮等[11]通過調節 EDC/NHS用量，制備了不同交聯度的CMCS水凝膠.上述文獻都僅研究了該類水凝膠的溶脹、生物降解、藥物緩釋等性能，而未對其力學性能、導電性能等進行分析研究.

聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸/二氧化硅（Poly（MMA/MAA）/SiO2，PMMS）乳膠粒，是一種表面負載納米SiO2的堿溶脹型陰離子乳膠粒子微球.該乳膠粒可以在堿性條件下發生體積溶脹，在pH值大于pKa（乳膠粒中含有羧基基團，其電離平衡常數pKa為7.5[12]）的條件下會發生溶脹，形成物理凝膠.在更高的pH值條件下，PMMS乳膠粒的高分子鏈會解纏結，形成舒展的聚合物鏈[12-14]，具有一定的pH調節性.基于此，本文擬以PMMS、CMCS、丙烯酰胺（AAm）為原料， EDC/NHS為催化劑，采用pH調節，通過自由基聚合反應制備CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠，并研究其流變性能、力學性能、溶脹性能、電導性能及生物相容性，以期為該類復合水凝膠在組織工程、傷口敷料、柔性電極等生物醫學和生物技術領域的應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：CMCS、AAm，上海麥克林公司生化科技有限公司產;MMA、MAA、NHS、EDC、過硫酸銨（APS）、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA），阿拉丁試劑上海股份有限公司產;NaOH， 天津市風船化學試劑科技有限公司產.以上試劑均為分析純.SiO2溶膠（Bindzil CC301），阿克蘇諾貝爾公司產;PMMS乳膠粒，鄭州輕工業大學實驗室自制;抗凝兔血，廣州鴻泉生物科技有限公司產.

主要儀器：DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產;RTS-9型雙電測四探針測試儀、AK-1140 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產;DZF-6030型真空干燥箱，上海新苗醫療器械制造有限公司產; HAKE MARSIII型哈克流變儀，美國Themo Fisher公司產;HY型微機控制萬能材料試驗機，深圳三思縱橫科技股份有限公司產;JSM-7001E型掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司產;DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司產;EFZ UV-4802H型紫外可見分光光度計，尤尼科（上海）儀器有限公司產.

1.2 PMMS乳膠粒的制備

參照課題組前期的合成方法[15-16]，以SiO2溶膠為穩定劑、MMA和MAA為共聚單體，通過Pickering乳液聚合的方法制備得到PMMS乳膠粒.

1.3 CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠的制備

稱取一定量質量分數為23%的PMMS乳膠粒，加水稀釋，攪拌均勻，使用注射器滴加微量質量分數為32%的NaOH溶液，調節溶液的pH值;然后，加入一定量質量分數為15%的CMCS溶液，再加入少量的EDC和NHS，攪拌30 min;最后依次加入一定量的AAm、MBA、APS，攪拌均勻，60 ℃下反應5 h，即可制得pH 值分別為6、7、9、10的CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠.

1.4 表征和測試方法

內部結構表征：將復合水凝膠快速冷凍后，置于加熱型冷凍干燥機中真空干燥至恒重，切片，噴金，使用掃描電子顯微鏡，在25 kV的加速電壓下觀察其內部結構.

流變性能測試：測試儀器為哈克流變儀;樣品規格為圓片狀，直徑為20 mm，高為4 mm;測試溫度為25 ℃;應變掃描范圍為0.1%～1000%，固定頻率為1 Hz.

力學性能測試：測試儀器為萬能材料試驗機;壓縮性能樣品規格為圓柱狀，直徑為 20 mm，高度為15 mm，壓縮速度保持為5 mm/min，測試溫度為室溫;拉伸性能測試樣品為啞鈴型，長度為60 mm，寬度為5 mm，厚度為3 mm，拉伸速率為20 mm/min，測試溫度為室溫.

溶脹性能測試：采用質量分析法，將復合水凝膠樣品自然風干后，稱質量，記為W0;將復合水凝膠浸泡在去離子水溶液中，按照一定時間間隔稱取水凝膠質量，記為Wd，直至溶脹平衡，溶脹率SR計算公式為

電導率測試：測試儀器為雙電測四探針測試儀;樣品規格為圓片，直徑為20 mm，高度為3 mm;每個樣品均重復3次，取平均值.

溶血性能測試：參考文獻[17]，將一定量離心所得新鮮抗凝兔血紅細胞加入37 ℃生理鹽水中，再加入一定量所制備的復合水凝膠，恒溫振蕩60 min，利用紫外分光光度計測量其545 nm處的吸光度（OD）.記ODa、ODb和ODc分別為實驗組、陽性對照（沒有浸泡復合水凝膠的去離子水兔血紅細胞溶液）和陰性對照（沒有浸泡復合水凝膠的生理鹽水兔血紅細胞溶液）的吸光度，溶血率HR計算公式為

細胞活性測試：委托公司為武漢賽維爾生物科技有限公司;采用甲基噻唑基四唑（MTT）法[18]，細胞活性CV計算公式為

其中，OD1為實驗組的吸光度，OD2為對照組的吸光度.

2 結果與分析

2.1 CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠的制備機理分析

在低pH值（酸性）條件下，PMMS微球內部的羧基（—COOH）沒有發生去質子化，微球仍以疏水性為主;隨著pH值的升高（中性和弱堿性），PMMS內部大量的—COOH發生去質子化，電離產生—COO-基團，微球從疏水性變為親水性，發生吸水溶脹，內部相互擠壓形成物理凝膠[19];在更高的pH值（高堿性）條件下，PMMS乳膠粒的高分子鏈在—COO-的相互排斥作用下解纏結，形成帶有—COO-基團的高分子鏈.利用PMMS具有經pH 誘導可從微粒到線狀離子鏈的結構變化的性質，通過簡單滴加NaOH溶液改變凝膠體系的pH值，制備出具有不同性能的CMCSPMMS /PAAm復合水凝膠.PMMS乳膠粒的pH響應機理示意圖見圖1.

2.2 CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠的結構分析

圖2為不同pH值條件下制備的CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠的SEM圖與實例圖.由圖2a）可以看出，在pH值為6和7的條件下所制備的復合水凝膠孔洞結構內部仍有小孔存在，整個結構呈大孔套小孔的現象.隨著pH值的不斷增大，這一結構逐漸消失，形成骨架厚實的單一孔洞結構.這可能是因為在較低pH值條件下，PMMS仍為納米級別的微球結構[5]，此時在網絡中雖有交聯，但由于微球結構的存在，CMCSPMMS網絡并不密集，主要以小片網絡的形式穿插在PAAm網絡中.而當pH值為9時，PMMS開始出現解纏結現象，成為聚合物長鏈，在EDC/NHS的作用下，與CMCS的交聯更緊密，網絡結構也更為規整，復合水凝膠孔洞的骨架也因此變得更加厚實.由圖2b）可以看出，復合水凝膠的透明度隨著pH值的增大而變大，這也從側面驗證了pH值對復合水凝膠結構的影響，以及PMMS在凝膠體系中發生了從微球到聚合物鏈的轉變.

2.3 CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠流變性能分析

圖3為不同pH值對CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠流變性能的影響.由圖3a）可以看出，儲能模量G′整體呈先減小后增大的趨勢，當pH值為6時，G′最大，為9200 Pa

.這可能是由于CMCSPMMS在EDC/NHS的作用下發生了交聯反應，雖然PMMS發生了溶脹，但是微球之間沒有相互擠壓，仍留有空隙可以與CMCS進行交聯.但當pH值與pKa（pKa=7.5[12]）值相等時，PMMS發生充分的溶脹擠壓，使其與CMCS的交聯點減少，凝膠內部結構不連續，多為游離的CMCS高分子鏈，G′出現下降趨勢.隨著pH值繼續增大，PMMS溶脹逐漸解開，體系中開始出現共聚物的高分子鏈，在EDC/NHS的作用下，高分子鏈部分與CMCS形成交聯網絡，G′有所升高.另外，由圖3b）可以看出，在不同pH值條件下，復合水凝膠的損耗因子tanδ在臨界應變前均小于0.1，這進一步表明復合水凝膠內部形成了有效的交聯[20].

2.4 CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠力學性能分析

圖4為不同pH值對CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠力學性能的影響.由圖4a）可以看出，當pH值為6和7時，復合水凝膠的抗壓縮強度較大，但易發生屈服破裂;而當pH值為9和10時，復合水凝膠可以承受壓縮應變至83%的變化而未出現屈服破裂的現象（此時的壓縮變量為現用儀器的最大壓縮量程）.由圖4b）可以看出，當pH值從6增至7時，復合水凝膠的斷裂伸長率和最大拉伸強度都得到明顯提升，這與壓縮性能結果基本一致;當pH值繼續增至9或10時，其拉伸強度有所降低，但斷裂伸長率增至178%左右，這說明復合水凝膠的韌性隨pH值的增大變得更好.這可能是因為當體系pH值為6和7時，復合水凝膠中PMMS部分仍為溶脹的微球，微球體積的增大造成微球之間相互擠壓，提升了PMMS之間的物理交聯點密度，雖然仍有游離的CMCS分子鏈存在，但是PMMS微球溶脹后的抗壓縮強度在體系中起主導作用，因此復合水凝膠呈現剛而強的狀態.這與先前研究報道[16]中，PMMS物理凝膠在pH值為6～7時機械強度最大的結果一致.隨著pH值的繼續增大，PMMS部分或全部解纏結變為舒展的高分子鏈，可以在凝膠體系中起到潤滑的作用，從而增加復合水凝膠的柔韌性.

基于力學性能結果，選取pH=10條件下制備的CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠樣品為模型，通過不間斷的循環壓縮評價抗疲勞性和形變恢復能力.圖5為CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠（pH=10）的循環壓縮曲線與耗散能變化趨勢.由圖5可以看出，復合水凝膠經歷8次循環壓縮至形變的80%后，除第1次循環外，其他循環壓縮曲線圖基本重合，滯后環基本一致，且在裝卸循環過程中存在明顯的滯后現象，這表明復合水凝膠可以有效耗散能量.盡管第1次循環壓縮耗散能較大，為1037 kJ/m3，但隨后第2次至第6次循環壓縮耗散能均值降低至860 kJ/m3，第7次和第8次循環壓縮的耗散能又有所升高，均值為900 kJ/m3.首次循環壓縮耗散能較大可能是復合水凝膠內部有結構缺陷的網絡發生了坍塌所致;在隨后的循環壓縮過程中，復合水凝膠的網絡結構漸趨穩定，從而耗散能變化減小，逐漸趨于平衡;而隨著循環壓縮次數的繼續增加，復合水凝膠內部游離的具有較大塑性形變能力的PMMS分子恢復形變的能力較弱，使耗散能又有所升高.

2.5 CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠導電性能分析

圖6為不同pH值對CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠導電性能的影響.從圖6a）可以看出，復合水凝膠的電導率隨體系pH值的增大略有升高，最高可達2.98×10-4 S/cm.這可能是因為復合水凝膠中羧基的電離程度隨體系pH值的升高也有所提升，即羧酸根濃度升高，復合水凝膠內部形成較好的離子導電通路，進而使其電導率增加.由圖6b）可以看出，將pH=10條件下制備的復合水凝膠作為導體連接在一個電壓為3 V的閉合電路中，電路中的二極管可以發光，這進一步表明該復合水凝膠具有良好的導電性.

2.6 CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠溶脹性能分析

溶脹能力是指水凝膠吸收純水、鹽溶液或生理鹽水的能力[21].圖7為CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠的溶脹性能曲線與溶脹前后抗壓縮能力對比圖.由圖7a）可以看出，pH值分別為6，7，9條件下制備的復合水凝膠在水中的的平衡溶脹率（約為600%）及達到溶脹平衡所需的時間相差不大.但pH值為10時所制備的復合水凝膠的平衡溶脹率卻高達860%.這可能是因為在堿性條件下復合水凝膠中未發生交聯的帶電離子基團（COO-）增加，盡管體系中氨基處于疏水狀態，但由于電荷排斥和滲透作用，復合水凝膠的平衡溶脹率也會隨之增大.

對于大多數吸水溶脹型的水凝膠，在達到平衡溶脹后，都會變脆，并失去彈性形變能力.但筆者發現，CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠即使在吸水達到溶脹平衡后，目測未見破損的痕跡，仍具有良好的壓縮形變性能.由圖7b）可以看出，復合水凝膠吸水后明顯變大，用手盡力壓縮溶脹后的凝膠，表面未見任何破裂之處，去除指壓，復合水凝膠瞬即恢復至原來的形態.由此可知， CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠具有應用于水環境的潛能.

2.7 CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠生物相容性分析

在生物醫學和生物技術領域的應用中，考慮到合成高分子材料PAAm及小分子交聯劑MBA與生物系統之間的相互作用[22]，對不同pH值條件下制備的CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠進行了溶血性能測試和細胞相容性研究，結果見圖8.由圖8可以看出，所有復合水凝膠樣品的溶血率均小于5%，細胞活性均在75%以上.溶血性能測試往往被認為是評估材料血液相容性簡單、可靠的方法.一般來說，溶血率應低于5%，且越低說明材料與血液的相容性越好[17].另外，根據文獻[22]，當某種材料表面細胞活性大于75%時，可認為該材料具有良好的生物相容性.由以上結果可知，CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠具有良好的血液相容性和細胞相容性，有望作為生物材料應用于生物傳感件、電子皮膚等領域.

3 結論

本文通過調節體系pH值和自由基聚合反應制備了一系列CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠，并考查了其流變性能、力學性能、導電性能、溶脹性能及生物相容性，得出如下結論：該復合水凝膠具有良好的流變性能、壓縮性能和穩定的拉伸應變能力，即使經吸水溶脹后，仍具有良好的抗壓縮性;具有良好的導電性和生物相容性，pH=10時電導率最高，可達2.98×10-4 S/cm，所有復合水凝膠樣品的溶血率均低于5%，細胞相對增殖率大于75%，均達到了國內相關標準對生物材料的要求[23].本文研究結果為CMCSPMMS/PAAm復合水凝膠在溶液環境下的應用提供了可能，也使該類復合水凝膠有望應用于軟骨修復、傷口敷料、生物傳感器件、電子皮膚等生物醫學領域.

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