3個尖塘鱧引進群體繁育后代的遺傳多樣性分析

林明輝　朱華平　蘇換換　樊佳佳　池金泉　馬冬梅

摘要：【目的】分析3個尖塘鱧引進群體繁育后代的遺傳多樣性和遺傳結構，為尖塘鱧親本管理和資源可持續利用提供基礎資料，同時為尖塘鱧的遺傳改良及新品種培育打下基礎。【方法】采用微衛星分子標記分析2000年引進的線紋尖塘鱧群體繁育后代（AZ1）、2005年引進的線紋尖塘鱧群體繁育后代（AZ2）及1986年引進的云斑尖塘鱧群體繁育后代（TG）的遺傳多樣性，運用PopGene32、CERVUS 3.0、Arlequin 3.1計算3個尖塘鱧群體的等位基因數（Na）、期望雜合度（He）、多態信息含量（PIC）及遺傳分化系數（Fst）等遺傳參數，基于Nei氏遺傳距離利用MEGA 7.0中的非加權組平均法（UPGMA）構建系統發育進化樹，并以Structure 2.3分析群體間的遺傳結構。【結果】12個微衛星分子標記在 3個尖塘鱧群體中擴增得到32個等位基因。AZ1群體、AZ2群體和TG群體的平均Na分別為1.33、1.92和2.33，平均He分別為0.034、0.180和0.214，平均PIC分別為0.031、0.155和0.191。3個尖塘鱧群體間的Fst為0.077～0.384、遺傳相似度為0.926～0.950、遺傳距離為0.052～0.077。3個尖塘鱧群體有22.54%的變異來自于群體間，77.46%的遺傳變異來自群體內。基于Nei氏遺傳距離構建的UPGM系統發育進化樹顯示，AZ1群體和AZ2群體先聚類為一支，然后與TG群體聚類在一起。【結論】3個尖塘鱧引進群體繁殖后代遺傳多樣性水平較低，尤其是AZ1群體近交程度較高，因此相關引種單位或繁殖場需盡快采取相應的選育手段提高現有雜交鱧群體遺傳多樣性，避免近交衰退帶來的風險，也可通過引進新的種質資源提高雜交鱧遺傳多樣性。此外，3個雜交鱧群體尚未出現種質混雜和雜交情況，仍可作為雜交鱧遺傳育種奠基種群。

關鍵詞： 云斑尖塘鱧;線紋尖塘鱧;微衛星分子標記;遺傳多樣性;遺傳結構

中圖分類號： S965.199? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）01-0213-08

Abstract：【Objective】The genetic diversity and genetic structure of offspring stocks of three imported Oxyeleotris populations in Guangdong were analyzed， in order to provide basic data for the management of the parent fish and the sustainable utilization of the Oxyeleotris resources， and to lay the foundation for genetic improvement and new variety bree-ding of Oxyeleotris. 【Method】Microsatellite markers were used to analyze the 90 offspring samples from the imported O. lineolatus populations AZ1 and AZ2 （introduced in 2000 and 2005 respectively） and the imported O. marmoratus population in 1986 （TG）. The genetic parameters， including number of alleles （Na）， expected heterozygosity （He）， polymorphism information content （PIC） and genetic differentiation coefficient （Fst） of the three populations were calculated by PopGene32， CERVUS 3.0 and Arlequin 3.1 software. The phylogenetic tree was constructed by UPGMA of Mega 7.0 program based on Neis genetic distance， and the genetic structure was calculated by Structure 2.3 software. 【Result】The results showed that a total of 32 alleles were identified in the three populations by using of 12 microsatellite markers. The number of average Na of the offspring samples for AZ1， AZ2 and TG populations were 1.33， 1.92， and 2.33 respectively; average He values were 0.034， 0.180， and 0.214; and average PIC were 0.031， 0.155， and 0.191， respectively. The Fst values ranged from 0.077 to 0.384， the genetic similarity values ranged from 0.926 to 0.950， and the genetic distance （Da） values ranged from 0.052 to 0.077. AMOVA analysis of the genetic variation revealed that only 22.54% of the genetic variation came from the inter-populations， and 77.46% genetic variation was from intra-populations among the three populations. UPGMA phylogenetic analysis based on Neis genetic distance showed that AZ1 and AZ2 populations first clustered together， and then clustered with TG population. 【Conclusion】The results indicate that the genetic diversity of the offspring stocks of three imported Oxyeleotris populations is low， and the inbreeding degree of AZ1 population is the high. It is urgent to carry out genetic improvement of Oxyeleotris as soon as possible and increase the number of parents by imported Oxyeleotris from different sources to increase the genetic diversity of the culture populations and avoid inbreeding decline risks. In addition， the three hybrid populations have not been mixed and hybridized， and can still be used as the foundation population of hybrid breeding.

Key words： Oxyeleotris marmoratus; Oxyeleotris lineolatus; microsatellite markers; genetic diversity; genetic structure

Foundation item： Guangdong Special Project for Promoting Economic Development（[]Modern Fishery Development Purpose）（Yuenong 2019B6）; Guangdong Science and Technology Plan Project （2017A040403008）; National Freshwater Germplasm Resource Center Construction Project （NFGR-2020）

0 引言

【研究意義】線紋尖塘鱧（Oxyeleotris lineolatus）和云斑尖塘鱧（O. marmoratus）隸屬于鱸形目（Percifomes）鰕虎魚亞目（Gobioidei）塘鱧科（Eletridae）尖塘鱧屬（Oxyeleotris），均為我國引進的名特優淡水養殖魚類。線紋尖塘鱧又稱澳洲筍殼魚，英文名為Sleepy cod，是澳大利亞特有的經濟魚類，我國分別于2000和2005年從原產地進行引種并繁育成功（莫介化等，2006;張邦杰等，2006）。云斑尖塘鱧俗稱泰國筍殼魚，英文名為Marble goby，原產地為泰國、越南等東南亞國家，于1986年引入我國并繁育成功（Zhao et al.，2017）。尖塘鱧因肉質白嫩爽脆、味道鮮美，而深受消費者青睞，在我國廣東、海南等地已呈規模化養殖，但由于線紋尖塘鱧和云斑尖塘鱧并非我國本土魚類，當前用于繁殖的親本均為引進奠基種群的繁殖后代，長期傳代極易導致近親繁殖，導致群體繁殖力下降、遺傳力減弱、抗病性和抗逆性降低等。為了確保證尖塘鱧養殖業的持續健康發展，非常有必要了解尖塘鱧資源現狀及不同引進群體的遺傳背景。【前人研究進展】目前，關于尖塘鱧的研究主要集中在形態生物學與核型分析（朱新平等，2003;張邦杰等，2004;陳永樂等，2006;Liu et al.，2019）、人工繁育與養殖技術（梁仁杰等，2004;郭建誼等，2014;Loo et al.，2015;Teoh et al.，2018）及機體免疫與病害防控（Wang et al.，2011;張新林等，2018;Guo et al.，2020）等方面。針對尖塘鱧的分子遺傳學研究，李春枝等（2006）基于線粒體12S rRNA序列分析線紋尖塘鱧、云斑尖塘鱧和海豐沙塘鱧系統發育關系，結果發現線紋尖塘鱧和云斑尖塘鱧均為單系類群，二者為親緣關系最密切的姐妹群，同時進一步證實線粒體12S rRNA序列可作為塘鱧科魚類種類鑒定的理想分子標記;范小勇等（2009）利用RAPD分析云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧及其雜交子一代（F1）的遺傳關系，結果顯示F1代所接受的雙親遺傳物質并非完全對等，其獲得的遺傳信息可能更多來自母本;王茜等（2009）基于線粒體16S rRNA序列分析6種塘鱧科魚類的系統發育關系，結果顯示線紋尖塘鱧與云斑尖塘鱧的親緣關系最近，而尖塘鱧屬與塘鱧屬魚類的同源性不高，驗證了傳統分類學將尖塘鱧獨立成屬的科學性;朱曉平等（2012）采用20對微衛星引物對線紋尖塘鱧（♀）、云斑尖塘鱧（♂）及其雜交、回交子代的遺傳變異進行分析，結果表明無論是雜交還是回交均表現出一定的母本效應;陳海港等（2016）基于線粒體COⅠ基因序列建立了鑒別云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧的分子標記;Zhao等（2017）基于線粒體DNA和微衛星分析云斑尖塘鱧的遺傳多樣性，結果顯示，在我國廣東和海南養殖的云斑尖塘鱧群體為中度多態性，與引進群體相比其多態性有所下降。【本研究切入點】生物遺傳多樣性分析是評價物種資源狀況的重要指標，也是動物遺傳育種研究的基礎，可為研究者提供重要的種質資源信息。因此，高效開展線紋尖塘鱧和云斑尖塘鱧的選擇育種研究之前，亟待對其引進群體繁育后代進行遺傳多樣性分析。【擬解決的關鍵問題】利用微衛星分子標記對3個尖塘鱧引進群體繁育后代進行遺傳多樣性分析，以期為尖塘鱧親本管理和資源可持續利用提供基礎資料，同時為尖塘鱧的遺傳改良及新品種培育打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

共采集90尾尖塘鱧樣品，包括2000年從澳大利亞引進的線紋尖塘鱧繁殖后代（AZ1）、2005年從澳大利亞引進的線紋尖塘鱧繁殖后代（AZ2）及1986年從泰國引進的云斑尖塘鱧繁殖后代（TG），各30尾。3個尖塘鱧引進群體繁殖后代樣品均采自廣州銳灃漁業發展有限公司保種基地，所有樣品均剪取尾鰭置于無水乙醇中，-20 ℃保存，用于基因組DNA提取。

1. 2 基因組DNA提取

采用動物組織基因組DNA提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）提取尖塘醴尾鰭基因組DNA，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整性，并以紫外分光光度計（AG22331型，美國Eppendorf公司）檢測其純度和濃度，-20 ℃保存備用。

1. 3 PCR擴增

從已公開發表的尖塘鱧微衛星分子標記（范小勇等，2009;朱曉平等，2012）中挑選12對具有多態性、擴增條帶清晰的微衛星引物（表1），用于尖塘鱧引進群體繁育后代遺傳多樣性分析。所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系20.0 μL：PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（TaKaRa）（1.25 U/μL）0.4 μL，5×PrimeSTAR GXL Bu-ffer（Mg2+ Plus）4.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.4 μL，基因組DNA 20 ng，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，各引物對應的退火溫度退火30 s，72 ℃ 30 s，進行25個循環;72 ℃延伸5 min。

1. 4 擴增產物檢測

PCR擴增產物采用8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，PCR擴增產物上樣量均為3.0 ?L（樣品與Buffer按3∶1混合），DNA Marker（50～500 bp）上樣量為0.5 ?L。電泳結束后，參照許紹斌等（2002）的方法進行硝酸銀染色。

1. 5 統計分析

根據每個個體產生的條帶位置確定其基因型，運用PopGene32計算3個尖塘鱧群體的等位基因數（Na）和期望雜合度（He）;基于Nei氏遺傳距離利用MEGA 7.0中的非加權組平均法（UPGMA）構建系統發育進化樹（Kuma et al.，2016）;采用CERVUS 3.0計算多態信息含量（PIC）（Kalinowski et al.，2007）;使用Arlequin 3.1計算群體間的遺傳分化系數（Fst）及進行群體分子方差分析（AMOVA）（Excoffier and Lischer，2010;孫成飛等，2015）;并以Structure 2.3分析群體間的遺傳結構（Almohammed and Hadi，2019）。

2 結果與分析

2. 1 尖塘鱧群體遺傳多樣性分析結果

以12對微衛星引物對3個尖塘鱧群體進行PCR擴增，均獲得清晰的目的條帶，圖1為H113引物在3個尖塘鱧群體中的部分擴增電泳結果。

由表2可知，12對微衛星引物在3個尖塘鱧群體中擴增得到32個等位基因。AZ1群體、AZ2群體和TG群體的平均Na分別為1.33、1.92和2.33個，平均He分別為0.034、0.180和0.214，平均PIC分別為0.031、0.155和0.191。根據PIC的判斷標準（PIC>0.50時為高度多態性，0.25

2. 2 尖塘鱧群體間的遺傳分化

利用Arlequin 3.1計算3個尖塘鱧群體間的Fst，結果顯示，AZ1群體與TG群體間的Fst最大（0.384），其次是AZ2群體與TG群體間的Fst（0.159），AZ1群體與AZ2群體間的Fst最小（0.077），即3個尖塘鱧群體間呈中度或高度分化。對3個尖塘鱧群體進行AMOVA分析，結果顯示，有22.54%的遺傳變異來自群體間，77.46%的遺傳變異來自群體內（表3）。

2. 3 尖塘鱧群體間的遺傳距離及聚類分析結果

依據Nei的方法計算3個尖塘鱧群體間的遺傳相似度和遺傳距離，結果如表4所示。3個尖塘鱧群體間的遺傳相似度為0.926～0.950，遺傳距離為0.052～0.077，表明3個尖塘鱧群體間的遺傳距離較近。根據Nei氏遺傳距離構建的UPGMA系統發育進化樹顯示，AZ1群體與AZ2群體先聚類為一支，然后與TG群體聚類在一起（圖2）。根據 90尾尖塘鱧個體間的遺傳距離構建UPGMA系統發育進化樹，結果發現3個尖塘鱧群體90尾尖塘鱧個體中基本表現為相同群體樣本聚在一起，但也有部分樣本呈鑲嵌式排列（圖3）。

2. 4 尖塘鱧群體間的遺傳結構分析結果

根據Structure 2.3執行假設K（1～7），當K=3時，對數似然函數值lnP（D）出現峰值（圖4），因此將所有分析個體分為3個理論群（圖5-A），即每個尖塘鱧群體單獨分為1個理論群，但由于AZ1群體和AZ2群體同屬于線紋尖塘鱧，而TG群體屬于云斑尖塘鱧，故繪制K=2的遺傳結構圖進行分析（圖5-B）。當K=2時，可將3個尖塘鱧群體分2個亞群，其中AZ1群體、AZ2群體和TG群體分別有91.6%、44.9%和21.3%隸屬于亞群Ⅰ，而剩余的8.4%、55.1%和78.7%隸屬于亞群Ⅱ。當K=3時，可將3個尖塘鱧群體分成3個亞群，其中AZ1群體、AZ2群體和TG群體分別有91.6%、24.9%和18.5%隸屬于亞群Ⅰ，2.3%、69.3%和10.9%隸屬于亞群Ⅱ，6.1%、5.9%和70.7%隸屬于亞群Ⅲ。

3 討論

群體遺傳多樣性是評價物種資源狀況的重要指標，遺傳多樣性降低說明種群的適應力和生存力下降，尤其是近親繁殖造成的遺傳變異水平下降會降低物種繁殖力和存活率，甚至增加滅絕風險（Souza-Shibatta et al.，2018）。Na、He和PIC等是衡量人工養殖群體遺傳多樣性的重要指標，其數值越大，表明群體遺傳多樣性越高（何金釗等，2017;張永德等，2020）。本研究選用12個微衛星分子標記對3個尖塘鱧群體的遺傳多樣性進行監測，結果顯示，每個微衛星分子標記在每個尖塘鱧群體中擴增的Na為1～5個，均低于范小勇等（2009）、朱曉平等（2012）采用相同分子標記在線紋尖塘鱧和云斑尖塘鱧群體所擴增獲得的參數值。尤其是在AZ1群體中，12個微衛星分子標記有8個單態位點，其平均He為0.034，平均PIC為0.031，表明AZ1群體雜合度較低，尚處于低度多態水平（PIC<0.25）。這可能是由于奠基種群數量少，群體經多代近交繁育，其群體已達高度純合水平。因近交種遺傳穩定，故AZ1群體可作為理想的遺傳育種材料。相對于AZ1群體，AZ2群體和TG群體的Na相對較高些，其中，AZ2群體有4個單態位點，TG群體有3個單態位點，其平均He分別為0.180和0.214，平均PIC分別為0.155和0.191，說明這2個尖塘鱧群體同樣屬于低度多態性，且近交水平較高。

Wright（1978）認為，Fst低于0.05時屬于低度遺傳分化，處于0.05～0.15之間屬于中度遺傳分化，高于0.15時屬于高度遺傳分化。本研究中，AZ1群體和AZ2群體均屬于線紋尖塘鱧，其Fst為0.077，屬于中度遺傳分化;而TG群體與AZ1群體、AZ2群體的Fst分別為0.384和0.159，均屬于高度遺傳分化，與TG群體屬于云斑尖塘鱧，AZ1群體和AZ2群體屬于線紋尖塘鱧相符。說明這3個尖塘鱧引進種引入我國后在養殖過程中尚未發生種質混雜。利用Structure 2.3分析3個尖塘鱧群體的遺傳結構，發現3個尖塘鱧群體獨立成群。若3個尖塘鱧群體分成2個亞群時，其分析結果顯示AZ1群體和TG群體相互獨立，但AZ2群體中有44.9%與AZ1群體隸屬于同一亞群，有55.1%與TG群體隸屬于同一亞群。

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（責任編輯 蘭宗寶）