薏苡仁提取物經PDGFB/PDGFRβ信號通路對口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

王鵬，何健民，王軍，高維岳

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一，約占口腔癌的90%，由于局部侵襲性和頸部淋巴結轉移的高趨勢，其5年生存率約為60%[1-2]。已有研究表明，血小板源性生長因子(PDGF)及其受體(PDGFR)之間的相互作用是癌細胞增殖、遷移和侵襲的關鍵[3]。血小板源性生長因子B(PDGFB)在所有PDGF亞型中親和力最高，與血小板源性生長因子受體β(PDGFRβ)相互作用誘導其磷酸化并激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，PI3K信號通路參與了許多細胞過程，包括細胞增殖、存活、運動和血管生成，提示PDGFB/PDGFRβ信號通路可能是一個治療靶點[4]。伊馬替尼是PDGFRβ的抑制劑，在臨床相關濃度(IC50<1 μmol/L)下以PDGFRβ特異性方式抑制卵巢癌細胞生長。但由于其毒性和不良反應較多，尋找低毒性藥物成為OSCC治療的重點[5]。薏苡仁油、薏苡仁多糖、薏苡仁油多肽等為薏苡仁主要活性成分，已被證明具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種作用，但其對OSCC的作用研究較少[6]。基于此，現探討薏苡仁提取物(ESC)通過PDGFB/PDGFRβ信號通路對人口腔鱗癌CAL27細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其潛在的機制，為OSCC的臨床治療提供理論依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1) 人口腔鱗癌CAL27細胞：購自中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心，批號 CM-1250)。(2)藥物與試劑： ESC(蘇州甫路生物科技有限公司),甲磺酸伊馬替尼(長沙嘉禎生物科技有限公司)；RPMI-1640培養基、超級胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司),四噻唑藍(MTT)(美國Amresco公司),結晶紫染液、聚偏氟乙烯膜、細胞蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術研究所)；PDGFB、PDGFRβ、磷酸化PDGFRβ(p-PDGFRβ)、PI3K、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)和β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Santa Cruz公司),辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。(3)儀器設備： Thermo Revco Elite Ⅱ型CO2培養箱、Multiskan MK3型酶標儀(美國Thermo公司)；3422型24孔Transwell小室(美國Corning公司),MA100N型顯微鏡(日本尼康公司),Coleparmer型垂直電泳儀(上海上碧實驗儀器有限公司),GelDoc IT TS2型凝膠成像儀(美國UVP公司)。

1.2 實驗方法 2020年6—8月在甘肅省人民醫院實驗室進行實驗。人口腔鱗癌CAL27細胞在37℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養，當細胞處于對數生長期時進行實驗，實驗分為對照組、ESC低劑量組、ESC高劑量組和伊馬替尼組。對照組：對數生長期人口腔鱗癌CAL27細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養；在對照組培養基礎上加入不同濃度相應藥物[7-8]，ESC低劑量組加入ESC 10 μmol/L，ESC高劑量組加入ESC 20 μmol/L，伊馬替尼組加入伊馬替尼10 μmol/L，均培養24 h后進行相關檢測。各項指標檢測每組均設3個復孔。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 MTT法檢測細胞增殖率：將CAL27細胞以5×103個/孔接種于96孔板中(200 μl/孔)，待細胞融合后，按以上方法給予ESC和伊馬替尼干預24 h，加入MTT(20 μl/孔)，37℃繼續培養4 h；96孔板中(200 μl/孔)只加培養基作為空白對照組。用酶標儀在630 nm處測定吸光度OD值，計算細胞增殖率：細胞增殖率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.2 細胞劃痕法檢測CAL27細胞遷移能力：將CAL27細胞以5×104個/孔接種于6孔板中(2 ml/孔)，待細胞融合，用100 μl滅菌槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，用無血清的RPMI-1640培養基清洗3次，并給予ESC和伊馬替尼干預24 h后，顯微鏡下拍照，用圖像分析儀測量0 h和24 h時劃痕寬度，遷移能力=0 h時劃痕寬度-24 h時劃痕寬度。

1.3.3 Transwell法檢測細胞體外侵襲能力：將CAL27細胞以5×104個/孔接種在24孔Transwell小室中(0.5 ml/孔)，下室加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，并給予ESC和伊馬替尼干預24 h，取出小室，用4%甲醛固定10 min，用0.1%結晶紫染液染色30 min，沖洗干凈后倒置顯微鏡下觀察細胞，計數紫色染色的穿膜細胞。

1.3.4 蛋白免疫印跡法檢測PDGFB、PDGFRβ、p-PDGFRβ、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平：將CAL27細胞以5×104個/孔接種于6孔板中(2 ml/孔)，待細胞融合，給予ESC和伊馬替尼干預24 h后收獲細胞，離心棄上清，余液根據細胞量加入細胞蛋白抽提試劑，裂解2 h；進行電泳(每孔上樣量為20 μg)，將印跡轉移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，將膜與PDGFB(1∶250)、PDGFRβ(1∶200)、p-PDGFRβ(1∶500)、PI3K(1∶300)、Akt(1∶200)、p-Akt(1∶300)和β-actin(1∶1 000)抗體進行孵育，4℃過夜，用TBST緩沖液對膜進行兩次沖洗，將二抗(1∶5 000)在室溫下孵育30 min。進行顯色，采集圖像進行分析。

2 結 果

2.1 各組CAL27細胞增殖、遷移能力和侵襲能力比較 與對照組比較，伊馬替尼組及ESC低劑量組、高劑量組CAL27細胞增殖率、遷移能力和細胞侵襲數均降低(P<0.05)，且伊馬替尼組

2.2 各組CAL27細胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達比較 與對照組比較，伊馬替尼組及ESC低劑量組、ESC高劑量組PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達均降低(P<0.05)，且伊馬替尼組

表1 各組CAL27細胞增殖、遷移能力和侵襲數比較

圖2 各組CAL27細胞遷移能力比較

圖3 各組CAL27細胞侵襲力比較(結晶紫染色，×200)

表2 各組CAL27細胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達比較

注：A.對照組；B.伊馬替尼組；C.ESC低劑量組；D.ESC高劑量組

2.3 各組CAL27細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達比較 4組CAL27細胞Akt蛋白水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，伊馬替尼組及ESC低劑量組、ESC高劑量組PI3K和p-Akt蛋白表達均降低(P<0.05)，且伊馬替尼組

表3 各組CAL27細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達比較

注：A.對照組；B.伊馬替尼組；C.ESC低劑量組；D.ESC高劑量組

3 討 論

OSCC是一種發病率較高的疾病，大多數患者由于復發和轉移而死亡。因此，迫切需要找到能有效抑制OSCC增殖和遷移的藥物。ESC是從薏苡仁中提取的天然物質，其成品制劑(康萊特注射液)已用于臨床腫瘤方面的治療[9-10]，但其涉及的潛在信號傳導途徑仍不清楚。本研究發現，ESC通過抑制PDGFB的表達，阻斷PDGFRβ的磷酸化并隨后抑制PDGFRβ介導的信號通路來抑制CAL27細胞增殖、遷移和侵襲。因此，PDGFB/PDGFRβ信號通路可能是ESC治療OSCC的靶點，可用于干預OSCC中異常細胞增殖、遷移和侵襲。

PDGF是體外平滑肌細胞和成纖維細胞的主要促分裂原，包含A、B、C和D等4個多肽，以二硫鍵的形式連接成同二聚體或異二聚體[血小板源性生長因子A(PDGFA)、PDGFB、PDGFC、PDGFD或PDGFAB]，與2個PDGF結合親和力不同的受體血小板源性生長因子受體α(PDGFRα)和PDGFRβ相結合[11]。研究表明，PDGFB和PDGFRβ之間的相互作用是細胞增殖和遷移及功能性脈管系統發展的關鍵[12]。PDGFB已被廣泛證明有助于人類和動物模型在血管損傷后的血管修復/重塑。如在球囊損傷后，大鼠頸動脈平滑肌細胞中PDGFB的表達上調，以刺激肌細胞的增殖和遷移[13]。另一方面，已證明抑制PDGFB信號可減少血管成形術后的血管修復/重塑[14]。PDGFB和PDGFRβ在多種人類上皮癌的自分泌刺激腫瘤生長及旁分泌刺激腫瘤相關的血管生成中也起著作用[15-17]。如在神經膠質瘤中，腫瘤細胞中PDGFB的水平與腫瘤的分級相關。已經在神經膠質瘤和乳腺癌的內皮細胞(EC)中觀察到PDGFRβ的高表達水平[18]。研究顯示，PDGFB主要在OSCC組織的腫瘤細胞中表達升高，表明通過PDGF-PDGFRβ募集成纖維細胞的旁分泌途徑[19]。一些研究表明，PI3K/Akt是經典的信號傳導途徑，其激活可誘導細胞生長并促進上皮間質轉化(EMT)和腫瘤轉移[20-22]。PDGFB高水平導致PDGFRβ磷酸化后，PDGFRβ募集PI3K、磷脂酶Cγ1和Src家族激酶和磷酸酪氨酸磷酸酶(SHP-2)等[23]。PDGFB通過細胞外調節蛋白激酶(Erk)激活β胰腺細胞中的細胞周期D1進程，而通過Akt激活平滑肌中的細胞周期[24]。PI3K/Akt途徑在細胞增殖和腫瘤發生中的作用通常與其下游靶標哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號分子結合。細胞周期蛋白D1調節劑如Akt和mTOR的水平變化在癌癥中也很常見，并且正在成為重要的治療靶點[25]。在內皮祖細胞(EPC)中可檢測到高水平的PDGFRβ，并且在不存在Akt信號傳導的情況下進一步誘導PDGFRβ[26]。本研究發現，ESC能抑制PI3K/Akt途徑的激活，發揮腫瘤抑制作用。因此，預測ESC對OSCC細胞生長和轉移的抑制作用是通過滅活PDGFB /PDGFRβ/PI3K/Akt軸來實現的。

綜上所述，ESC可抑制CAL27細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與抑制PDGFB/PDGFRβ信號通路的激活有關，為OSCC的分子靶向治療提供了理論依據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王鵬：設計研究方案，課題設計，實施研究過程，論文撰寫；何健民：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；王軍：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；高維岳：進行統計學分析