二甲雙胍對非酒精性脂肪性肝病細胞模型內質網應激與自噬的影響

吳曉曼，張敏，田甜，李明，廖星晨，譚詩云

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是全世界慢性肝病的最常見原因，據估計，世界上有24%的人口患有NAFLD，到2030年，美國將有大約1億人患有NAFLD[1]。NAFLD的階段范圍從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)，進一步可能發展為肝硬化，導致肝功能衰竭需要肝移植，甚至最終發展為肝細胞癌[2]。NAFLD近年來大多共識為一種代謝性疾病，其發病機制多與脂肪代謝有關，肝細胞三酰甘油(TG)積累是NAFLD的標志，在肝細胞中由于過多的脂質蓄積可引發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)與自噬的變化[3-4]。在NAFLD發病機制的研究中發現，代謝因素(如胰島素抵抗、糖毒性和脂毒性等)、遺傳因素和其他因素促成NAFLD與2型糖尿病(T2DM)的發病呈現相關性，患者存在T2DM增加了NAFLD進一步發展的風險[5]。而二甲雙胍作為一種雙胍類降糖藥物，已被用于治療2型糖尿病超過60年[6-7]。在近期的研究中[8]，發現二甲雙胍可抑制高脂飲食(HFD)誘導的肝脂肪變性。本研究利用游離脂肪酸(FFA)建造NAFLD細胞模型并用二甲雙胍進行干預，進一步研討ERS與自噬的調控機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞株：人肝癌細胞株HepG2由中國科學院干細胞庫提供。(2)試劑試藥：二甲雙胍購于美國MCE(HY-17471A)，Gibco DMEM/H培養液購自美國賽默飛世爾公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司。棕櫚酸(palmitic acid, PA)(P0500)、油酸(oleic acid, OA)(O1383)購自美國Sigma公司，細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、胰酶細胞消化液購自biosharp公司，無脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購自上海翊圣公司。兔抗RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶 (RNA-dependent protein kinase-like ER eukaryotic initiation factor-2α kinase, PERK)抗體、兔抗激活作用轉錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)抗體、兔抗微管相關蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light 3，LC3)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗P62抗體、鼠抗GAPDH抗體購自美國proteintech公司，兔抗磷酸化PERK抗體購自北京博奧森公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(ZB-2301)購自北京中杉金橋公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(BS12478)購自美國bioworld公司。(3)儀器設備：THERMOHeracellVIOS 160i/250i CO2培養箱(德國Thermo Scientific公司)，Bio-Rad imark 全自動酶標儀、Bio-Rad凝膠成像系統ChemiDocTMXRS+、OLYMPUS IX71顯微鏡、垂直層流潔凈工作臺(青島海爾公司)，XB70-FZ制冰機(GRANT公司)，XSR205微量稱重臺(METTLER TOLEDO公司)。

1.2 實驗方法 2020年7—11月于武漢大學人民醫院消化系統疾病湖北省重點實驗室進行實驗。

1.2.1 FFA配置：以配置FFA 6 ml(OA︰PA=2︰1)為例，先稱量無脂肪酸BSA 1.2 g加入PBS 2.5 ml高速離心助溶后配至3 ml，配置成40%無脂BSA淡黃色澄清溶液。取NaOH 0.04 g，溶解于去離子水10 ml中，配成0.1 mol/L NaOH溶液10 ml，取NaOH溶液3 ml依次加入PA 10.24 mg、OA 25.38 μl配置40 mmol/L FFA，置于75℃水浴進行充分皂化約30 min得到澄清液體。將其與BSA 3 ml迅速混合，可在50 ℃以下助溶，得到20 mmol/L FFA溶液6 ml為母液，4 ℃保存。

1.2.2 HepG2細胞培養：將凍存的HepG2細胞置于37 ℃恒溫水浴中約1 min內迅速解凍，離心5 min后去除凍存液，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM完全培養基重懸之后移至25 cm2的培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，隔天換液，每天觀察細胞生長情況，3～4 d傳代1次。傳代操作如下：棄去培養基，PBS 3～4 ml清洗2次，加入胰酶1～2 ml，置于培養箱中消化1～2 min，倒置顯微鏡下觀察，若細胞大部分變圓分散，則在培養瓶中加入與胰酶等量含10%胎牛血清的DMEM完全培養基終止消化，收集細胞后離心棄上清，以1∶3比例傳代，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.3 NAFLD細胞造模及分組：取合適數量的對數生長期HepG2細胞接種于孔板中，分為4組：對照組(BSA組)、模型組(FFA組)、二甲雙胍低濃度組(Met L組)、二甲雙胍高濃度組(Met H組)。隔夜觀察細胞生長狀態良好，進行藥物干預。二甲雙胍先用去離子水配置500 mmol/L 母液，-20 ℃保存。Met L組和Met H組分別采用二甲雙胍1、10 mmol/L終濃度進行預處理1 h，然后FFA、Met L、Met H組分別加入等量FFA進行干預，使FFA作用濃度為1 mmol/L，BSA組加入與FFA等量的BSA，作用24 h后結束NAFLD細胞造模及藥物處理進行其他檢測。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 CCK8法檢測細胞活性：收集對數生長期的HepG2細胞,以5 000/孔的密度接種于96孔板中，每孔含 10%FBS的DMEM培養基100 μl，在細胞培養箱中孵育24 h后，用PBS清洗1遍加入新的培養基100 μl，并分別以0、10、20、40、80 mmol/L濃度的Met處理細胞,空白對照組加入等體積的DMEM完全培養基,放回孵育箱中繼續培養24 h。棄去原培養基，每孔加入100 μl無血清DMEM培養基和 CCK-8試劑10 μl，于37℃恒溫箱中避光孵育1.5 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度(OD)值，根據公式計算細胞活力。細胞活力=[(干預組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.3.2 Western-blot法檢測蛋白表達：取對數生長期細胞接種于6孔板中,每孔加入DMEM 2 ml完全培養基37℃恒溫箱中培養。細胞分組加入藥物干預24 h后, PBS洗滌3遍。按照RIPA∶磷酸酶抑制劑∶PMSF=100∶2∶1配置裂解液，每孔加入配置好的裂解液100 μl，冰上裂解10 min，用細胞刮刀收集細胞進行超聲裂解，然后于4℃離心取上清加入loading buffer，100℃煮沸10 min。BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，根據測得濃度調整上樣量。將蛋白樣品加入十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，后經電泳、轉膜，將轉膜結束后的PVDF膜取出，轉入含5%脫脂奶粉的TBST中封閉60 min。分別孵一抗，稀釋比1∶1 000，4℃過夜，回收一抗，加入TBST洗滌5次，每次10 min，二抗稀釋比1∶2 500，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。用ECL 化學發光液浸潤1 min，于凝膠成像系統中掃描成像。

1.3.3 qRT-PCR實驗檢測ATF4基因表達水平：細胞接種及分組同上，培養24 h后，收集細胞提取總RNA，計算出RNA濃度，按試劑盒操作說明合成cDNA，并進行聚合酶鏈反應(PCR)檢測ATF4表達水平，以GAPDH為內參。qRT-PCR實驗條件為95 ℃ 3 min預變性，95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s重復40個循環。ATF4正向引物為5'-GTCCTGTCCTCCACTCCAGATC-3'，反向引物為5'-TGGGCTCATACAGATGCCACT-3'；GAPDH正向引物為5'-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3'，反向引物為5'-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'。目的基因擴增用ΔΔCT法計算，A=CT(目的基因, 實驗樣本)-CT(內標基因, 實驗樣本)，B=CT(目的基因, 對照樣本)-CT(內標基因, 對照樣本)，K=A-B，表達倍數=2-K。

2 結 果

2.1 二甲雙胍對HepG2細胞活力的影響 采用不同濃度(0、10、20、40、80 mmol/L)二甲雙胍干預HepG2細胞24 h后,檢測細胞活力,結果顯示，相同時間范圍內,不同濃度的二甲雙胍對HepG2細胞活力的抑制隨劑量升高而增強,差異均有統計學意義(F/P=1 759.000/0.000)，見圖1。

圖1 不同濃度的二甲雙胍對HepG2細胞活力的影響

2.2 各組HepG2細胞ERS相關蛋白表達比較 Western-blot結果顯示，與BSA組比較，FFA組PERK磷酸化程度明顯升高 (t/P=3.273/0.029)；與FFA組比較， Met L組和Met H組PERK磷酸化程度降低 (F/P=70.310/0.000)；與Met L組比較，Met H組PERK磷酸化程度降低更明顯(t/P=6.402/0.000)，見圖2。

圖2 各組PERK磷酸化程度比較

Western-blot結果顯示，與BSA組比較，FFA組ATF4蛋白表達水平明顯升高 (t/P=47.290/0.000)；與FFA組比較，Met L組和Met H組ATF4表達水平降低 (F/P=995.600/0.000)；與Met L組比較，Met H組ATF4表達水平降低更明顯(t/P=25.590/0.000)，見圖3。

圖3 各組ATF4蛋白表達比較

2.3 各組HepG2細胞ATF4 mRNA表達比較 通過qRT-PCR檢測，與BSA組比較，FFA組ATF4 mRNA水平明顯增高 (t/P=13.730/0.000);與FFA組比較,Met L組和Met H組ATF4 mRNA表達水平均降低(F/P=66.960/0.000)；與Met L組比較，Met H組ATF4 mRNA表達水平降低(t/P=3.511/0.048)，見圖4。

圖4 各組HepG2細胞ATF4 mRNA表達比較

2.4 各組HepG2細胞內自噬水平比較 通過Western-blot法檢測各組細胞中自噬相關蛋白p62和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達情況，與BSA組比較，FFA組p62蛋白表達升高(t/P=16.190/0.000)，LC3-Ⅱ/Ⅰ表達降低(t/P=17.980/0.000)，差異有統計學意義(P<0.05)；與FFA組比較， Met L組和Met H組細胞p62蛋白顯著降低(F/P=106.700/0.000)，而細胞內LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白比例顯著升高(F/P=166.400/0.000)。且與Met L組比較，Met H組LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白比例升高(t/P=3.474/0.028)，見圖5。

圖5 二甲雙胍對HepG2細胞內自噬水平的影響

3 討 論

二甲雙胍屬于雙胍類藥物，是目前臨床首選降糖藥，主要通過減少肝臟葡萄糖的輸出和改善外周胰島素抵抗而降低血糖[9]。有研究表明[10]，二甲雙胍在高脂飲食誘導的小鼠中可明顯降低凋亡水平，說明二甲雙胍具有治療非酒精性脂肪性肝病的潛力。為進一步探討二甲雙胍作用于非酒精性脂肪性肝病的體外作用機制， 應用CCK8法檢測二甲雙胍對人肝癌細胞HepG2細胞活力的影響。本結果篩選出對細胞影響最小的濃度范圍，選擇1、10 mmol/L的二甲雙胍進行后續實驗，結果顯示，二甲雙胍可劑量依賴性地降低HepG2細胞活力，與Guo等[11]研究結果一致。

研究表明，FFA可引起肝細胞內脂質蓄積，ERS水平升高[12-14]。ERS是指由于細胞受到外界刺激或自身某些變化因素導致內質網穩態失衡，進而未折疊或錯誤折疊的蛋白質累積在內質網內對細胞產生毒性，引發內質網發生非折疊蛋白質應答(unfolded protein response,UPR)，進而消除和避免未折疊蛋白質的進一步積累，從而維持細胞穩態。ERS有3條經典的信號通路：PERK、IRE1α和ATF6，當ERS被激活時，這3種蛋白分別活化并進一步激活下游的信號分子傳遞信號[15-16]。其中PERK通路被證實參與NAFLD的發生發展機制[17]，在本實驗中，進一步證實其下游信號分子ATF4參與FFA建造的NAFLD細胞模型的疾病發展機制。PERK通過自身磷酸化被激活，進一步磷酸化eIF2α，然后ATF4水平上升進而調節細胞代謝。自噬存在3種不同類型，分別為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。廣義自噬多指巨自噬，指在細胞內形成包裹部分細胞老化細胞器或碎片的雙膜囊泡，即自噬體，自噬體與溶酶體結合使其包裹內物質降解，是細胞自我消化的一種方式[18-19]。Song等[20]研究表明，ERS下游PERK信號通路參與誘導自噬，但本研究中FFA組誘導ERS PERK信號通路激活且下游ATF4同樣被激活，與BSA組比較，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，自噬水平降低。LC3有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2種分子形式，發生自噬時，溶質形式的LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺綴合形成LC3Ⅱ，隨后被募集到自噬體膜中，是自噬的特異性標志[21]。最近的研究表明[22]，高脂飲食喂養建造的NAFLD小鼠模型中，自噬水平降低，在體外實驗中也證明棕櫚酸干預會使自噬通量受阻，與本研究結果一致。ERS與自噬之間的相互作用在不同的疾病或模型中有所不同，在NAFLD模型中，多出現ERS水平上升及自噬受阻。

本研究也進一步證實了二甲雙胍在NAFLD模型中對ERS的影響，這與Chen等[23]研究一致，二甲雙胍可降低癲癇持續狀態(status epilepticus, SE)誘導的ERS水平，通過PERK-eIF2α-C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP/GADD153)信號通路可直接減少SE模型中的凋亡水平。在NAFLD模型中二甲雙胍也可影響ERS PERK信號通路，且在本實驗中進一步說明其下游分子ATF4也受二甲雙胍調控。無論在何種細胞內，二甲雙胍均可激活腺苷酸活化蛋白激酶，AMPK作為一種已知的細胞代謝傳感器,參與細胞內多種信號傳導通路調節[24]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是自噬調節的重要信號分子，而AMPK的激活可抑制mTOR[25]。Hu等[24]研究表明，二甲雙胍可調控mTOR信號通路，而mTOR信號通路也可進一步負調控自噬。本實驗證實，二甲雙胍組可明顯增加因FFA降低的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，且自噬相關蛋白p62水平明顯降低，說明二甲雙胍可恢復因FFA脂毒性降低的自噬水平，可能有助于進一步減少細胞內脂質蓄積。

綜上所述，二甲雙胍可有效保護肝細胞免受FFA的脂毒性，緩解其ERS并增強自噬水平，對NAFLD有潛在的治療作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

吳曉曼、張敏：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；田甜、李明：分析試驗數據，論文審核；廖星晨：資料搜集整理；譚詩云：課題設計，論文終審