mcr-1陽性類噬菌體質粒與F33∶A-∶B-質粒共整合形成的融合質粒的生物學特性分析

王亮亮,王倩倩,朱瑩瑩 ,龐子峰,朱玉喜,植嬋萍,潘玉善,劉建華,賀丹丹*

(1.河南農業大學,河南 鄭州 450000；2.廣東茂名農林科技職業技術學院,廣東 茂名 525000)

F33∶A-∶B-型質粒是多重耐藥質粒IncF型質粒中最為流行的亞型之一,它廣泛存在于腸桿菌科細菌,尤其是大腸桿菌中,是介導fosA3、blaCTX-Ms和rmtB等耐藥基因快速傳播的主要載體[1-3]。F33∶A-∶B-型質粒除了能夠借助IS26和IS1294元件捕獲和傳播抗性基因外,還能夠獲得IncN1、IncI1、IncR和IncX1型質粒的一些片段成為多復制子質粒[3]。本課題組在研究豬源大腸桿菌中mcr-1的水平轉移能力時,首次發現在接合過程中,F33∶A-∶B-型質粒pD72-F33捕獲了大約96 kb的mcr-1陽性類噬菌體質粒pD72-mcr-1形成融合質粒pD72C；序列分析發現,其質粒融合機制是pD72-F33上1個拷貝的IS26攻擊pD72-mcr-1上8 bp的目標位點(CAGCATTT)[4]。

質粒介導的粘菌素耐藥基因mcr-1已經成為全球關注的重點。自2015年mcr-1被首次報道后,該基因在世界范圍內不同來源的不同菌種中廣泛出現[5-7]。不同的mcr-1陽性不相容群質粒不斷被報道,尤其是較流行的IncI2、IncX4和 IncHI2型質粒,它們所具有的較高的穩定性和適應性優勢對mcr-1的快速傳播起到重要作用[8-10]。除了可接合性質粒,Tn6330 (ISApl1-mcr-1-ISApl1)與mcr-1的快速傳播密切相關,Tn6330能夠通過形成環形中間體形式促使mcr-1插入到其它細菌的染色體或質粒的TA富集區[11-14]。目前報道的mcr-1陽性類噬菌體質粒具有較高的核酸序列同源性,其中大多數不具有自身轉移性,因此這類質粒對mcr-1的快速水平傳播作用具有局限性[4]。本研究中的mcr-1陽性類噬菌體質粒pD72-mcr-1具有不可接合性,然而,可接合性F33∶A-∶B-型質粒與之融合后的共整合質粒具有可接合性,這暗示F33∶A-∶B-型質粒能夠作為1個接合輔助質粒提供給不可接合質粒的接合轉移能力,進而促使mcr-1的快速傳播[4]。質粒融合使質粒進化成攜帶更多耐藥基因的質粒,然而該融合質粒在受體菌中是否能夠穩定存在？對受體菌是否產生適應性代價？對該融合質粒的融合頻率和接合頻率也不清楚。鑒于此，我們研究了該融合質粒的生物學特性,評估了攜帶mcr-1多重耐藥融合質粒在宿主菌中的適應性、融合和擴散能力,旨在為多重耐藥融合質粒介導mcr-1傳播的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株信息

大腸桿菌D72菌株分離自豬肛門拭子樣品;接合實驗得到攜帶融合質粒pD72C(blaCTX-M-55陽性F33∶A-∶B-型質粒pD72-F33與mcr-1陽性類噬菌體質粒pD72-mcr-1的共整合質粒)的接合子D72C、攜帶pD72-F33質粒的接合子D72C-2。標準菌E.coli25922及工程菌E.coliDH5α、E.coliC600、E.coliJ53為本實驗室保存。采用微量肉湯稀釋法測定原菌、受體菌及接合子的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。

1.2 質粒轉化實驗

用小提質粒試劑盒分別提取兩個接合子的質粒,通過電轉化分別將質粒轉入受體菌E.coliDH5a中,獲得攜帶pD72C的轉化子D1和攜帶pD72-F33的轉化子D2。

1.3 生長曲線測定

將接合子D72C、D72C-2和E.coliC600劃線培養后,分別挑取單菌落到2 mL空白LB肉湯中,于37 ℃下以200 r/min的轉速過夜培養。分別測定接合子D72C、D72C-2的母液的OD值,取OD值最接近的母液進行下一步實驗。從母液中吸取200 μL接種到含20 mL新鮮LB肉湯的錐形瓶中,在37 ℃下以200 r/min震蕩培養。每隔1 h準確吸取200 μL到96孔板中,平行吸取3次,以空白的LB肉湯作為空白對照,測定在600 nm處的吸光值OD600。

1.4 質粒穩定性實驗

將接合子D72C和D72C-2分別劃線于LB瓊脂培養基上,在37 ℃下過夜培養。挑取單菌落，將其接種至50 mL無抗LB肉湯中，過夜傳代培養,每株菌3個平行。吸取50 μL培養液，重復接種至新的50 mL無抗LB肉湯中，連續傳代9 d。每隔1 d進行1次檢測,吸取20 μL細菌培養液,用滅菌生理鹽水倍比稀釋到合適濃度,在無抗LB瓊脂培養基上均勻地滴稀釋液,每個稀釋梯度滴3個平行,過夜培養。參照本課題組先前研究報道[4]中的引物,對在無抗LB瓊脂平板上生長的所有菌落進行PCR鑒定。

1.5 體外競爭性實驗

為了評估融合質粒pD72C和親本質粒pD72-F33對宿主適應性的影響,采用轉化子D1、D2與E.coliDH5a進行體外競爭實驗。挑取D1和E.coliDH5a,分別接種于2 mL無抗LB肉湯中,于37 ℃、200 r/min搖床上培養12～16 h。取OD600值最相近的初始培養物母液,以1∶1的比例均勻混合。分別取100 μL混合液接種到100 mL空白LB肉湯中(1∶1000),同時設4個平行,設此時為競爭性實驗0 h。于37 ℃、200 r/min條件下震蕩培養24 h后,取混合液100 μL接種到100 mL新鮮空白LB肉湯中(1∶1000)。此操作每24 h重復1次,連續4 d。在培養的0、24、48、96 h時,對混合培養物各取50 μL培養液,利用滅菌生理鹽水將其倍比稀釋到合適的濃度，然后涂布于無抗LB瓊脂板,在37 ℃下培養14～18 h。將從LB瓊脂板上獲得的單菌落全部轉接到2 μg/mL粘菌素LB瓊脂板上,于37 ℃恒溫下培養14～18 h。參照文獻[4]報道的引物,進行菌落PCR鑒定。轉化子D2的體外競爭實驗也進行相同的操作。最后,參照文獻[15]的報道,根據以下公式計算相對適應度RF：RF=(lgS1d1-lgS1d0)/(lgS2d1-lgS2d0),式中S1d1和S1d0分別是轉化子在24、48、72、96和0 h時的菌落數；S2d1和S2d0分別是DH5a在24、48、72、96和0 h時的菌落數。當RF>1時,表明轉化子相對于宿主菌有競爭優勢;當RF=1時,表明質粒對宿主菌不產生適應性代價;當RF<1時,說明質粒對宿主菌造成了較大的適應性代價,轉化子處于競爭劣勢。體外競爭性實驗重復3次,結果取RF的平均值。

1.6 質粒的融合頻率和接合頻率

以原菌D72為供體,以利福平抗性E.coliC600為受體,通過接合實驗觀察pD72-mcr-1和pD72-F33∶A-∶B-融合質粒的形成能力。分別在添加頭孢噻肟(2 mg/L)和利福平(450 mg/L)的麥康凱瓊脂板上，以及添加黏菌素(2 mg/L)和利福平(450 mg/L)的麥康凱瓊脂板上篩選接合子。進一步以攜帶融合質粒pD72C和攜帶pD72-F33質粒的接合子D72C和D72C-2為供體,以疊氮鈉抗性E.coliJ53為受體進行接合實驗,在含有黏菌素(2 mg/L)和疊氮鈉(100 mg/L)、頭孢噻肟(2 mg/L)和疊氮鈉(100 mg/L)的瓊脂板上篩選J53接合子,以評價融合質粒和親本質粒的水平轉移能力。參照文獻[4]報道的引物,對所有接合子進行PCR鑒定。融合頻率的計算:融合頻率=攜帶融合質粒pD72C的接合子數量/攜帶親本質粒pD72-F33的接合子數量。接合頻率計算:接合頻率=接合子數量/ (C600數量+接合子數量)。

2 結果與分析

2.1 接合子及原菌的藥敏性

從表1可以看出：原菌D72對多種藥物耐藥；攜帶融合質粒的接合子D72C對頭孢喹肟和粘菌素的MIC值比受體菌分別升高了約512倍和64倍；blaCTX-M-55陽性質粒pD72-F33的接合子D72C-2對粘菌素敏感,而對頭孢喹肟的MIC值比受體菌升高了約512倍。這些耐藥表型與接合子攜帶的耐藥基因一致。

表1 大腸桿菌分離株D72、接合子及受體菌的MIC值 mg/L

2.2 細菌的生長曲線

以時間(h)為橫坐標,以不同時間點的平均OD600值為縱坐標,繪制 D72C、D72C-2和E.coliC600的生長曲線。最初D72C、D72C-2和E.coliC600母液的OD600值比較接近,分別為0.035、0.033和0.031。圖1顯示,所有菌株均在4 h時達到對數期,在10 h時達到穩定期,且各時間節點的OD600值相近,3株菌的生長曲線趨于一致,即接合子和受體菌的生長能力相似。

2.3 質粒的穩定性和競爭性

質粒的穩定性實驗結果顯示,在不含抗生素的環境中,融合質粒pD72C和親本質粒pD72-F33連續傳代9 d后仍能保持穩定存在,說明該質粒具有較高的穩定性,其攜帶的抗性基因可以穩定遺傳。競爭性實驗結果(圖2)顯示,在培養過程中,攜帶融合質粒pD72C的轉化子D1和攜帶親本質粒pD72-F33的轉化子D2數量都高于受體菌E.coliDH5a的數量,相對適應度RF均大于1,說明融合質粒pD72C和親本質粒pD72-F33對宿主菌均呈現出適應性優勢。融合質粒pD72C的相對適應性高于pD72-F33的相對適應性,尤其是在96 h時,質粒pD72-F33的相對適應度性稍微降低,而融合質粒pD72C的突然增大,表現出比pD72-F33更明顯的競爭優勢。

2.4 質粒的融合頻率和接合頻率

實驗結果表明：質粒的融合頻率較高,為6.43×10-3；融合質粒pD72C和親本質粒pD72-F33的接合頻率分別為0.82×10-1和3.19×10-1。

3 討論

適應性是指耐藥菌在沒有藥物選擇壓力的情況下生長、定殖等方面的能力。細菌在藥物的選擇壓力下,可以通過染色體基因突變和質粒上耐藥基因的水平轉移等獲得耐藥性以適應環境的變化,但是當藥物選擇壓力去除后,耐藥菌株中基因的突變、外源基因的表達以及質粒的導入等會對宿主菌造成負擔,其適應性可能低于敏感菌,在菌群中逐漸成為劣勢菌,這一現象稱為適應性代價。一般說來,質粒和染色體抗性基因都會導致細菌適應性代價的產生[16]。耐藥菌的適應性研究主要包括耐藥菌是否能快速適應宿主或環境?能否在與敏感菌的生長競爭中成為優勢菌群？質粒的穩定性是指質粒經復制后分配到子代細菌中的能力。耐藥質粒在宿主菌中穩定的傳代可以保證耐藥性的維持,同時有更多的機會傳遞到其他菌中,增加耐藥基因傳播的機會。

本文通過融合質粒的穩定性、生長競爭性實驗，以及融合頻率和接合頻率來研究融合質粒的生物學特征,以評估在接合過程中形成的多重耐藥融合質粒對宿主菌的適應性、融合和擴散能力。本研究通過測定生長曲線、質粒穩定性、體外競爭實驗來分析mcr-1陽性類噬菌體質粒與blaCTX-M-55陽性F33∶A-∶B-型質粒共整合形成的融合質粒對宿主的適應性代價。發現接合子D72C、D72C-2和E.coliC600的生長曲線基本一致,表明該融合質粒不影響宿主菌的生長能力。融合質粒和親本質粒pD72-F33在無抗條件下能夠穩定傳代9 d,這表明通過共整合形成的融合質粒比較穩定,有促進多重耐藥菌株形成的可能。體外競爭實驗結果表明融合質粒和親本質粒不對宿主菌產生適應性代價。何良英等[17]報道了犬源大腸桿菌7A8的F33∶A-∶B-型多重耐藥質粒pHN7A8在宿主菌JM109中具有較高的穩定性和適應性。F33∶A-∶B-型質粒上存在的一些沉溺系統可以提高質粒的穩定性和適應性,這可能是F33∶A-∶B-型質粒在腸桿菌中流行的主要原因[1]。本研究發現,攜帶融合質粒的轉化子的相對適應性高于親本質粒的相對適應性,尤其是在培養96 h時,融合質粒的相對適應性突然增大,這表明質粒融合后,并沒有因為獲得較大序列片段而增加宿主的負擔,反而有利于宿主的生存,其具體的原因有待進一步研究。本研究結果顯示，該融合質粒具有較高的融合頻率和接合頻率,說明可接合性F33∶A-∶B-質粒能夠以較高的頻率捕獲不可接合性mcr-1陽性類噬菌體質粒,進而促進mcr-1的水平傳播,并且在捕獲類噬菌體質粒這個較大的片段后,F33∶A-∶B-質粒自身的轉移性和適應性不受到影響。本研究中攜帶mcr-1的類噬菌體質粒本身不具有可接合性,而該質粒通過與可接合的blaCTX-M-55陽性F33∶A-∶B-型質粒pD72-F33融合,不僅使自身具有了可接合性,而且不對宿主菌產生適應性代價,同時有著較高的融合頻率和接合頻率。該融合質粒所具有的良好的生物學特性可能會促使mcr-1的快速傳播及多重耐藥質粒的進化,這將導致多重耐藥菌的產生,從而給臨床感染治療帶來挑戰。以后應進一步研究影響質粒融合的因素,為采取相應措施避免多重耐藥融合質粒的形成及傳播提供理論依據。

4 結論

mcr-1陽性類噬菌體質粒和F33∶A-∶B-質粒共整合形成的融合質粒在宿主菌中能夠穩定傳代,對宿主菌有較好的適應性優勢,擁有較強的擴散能力。