金櫻子提取液對H2O2誘導HaCaT細胞氧化損傷保護作用研究

劉盈，何嘉祺，顏秋燦，葉菲菲

(中山大學新華學院藥學院，廣東 廣州 510520)

金櫻子(RosalaevigataMickx.,RLM)屬薔薇科薔薇屬常綠蔓性灌木，主要藥效成分有氨基酸、多糖、黃酮類、三萜類物質及其衍生物等[1-2]，其成熟果實可入藥，味酸、甘、澀，性平，有補血益精，澀腸止瀉之效，可增強免疫力、抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、保護腎臟、抗心律失常等藥理作用[2-3]。相關研究發現，金櫻子果實中的水溶性多糖能夠消除陰離子自由基，減輕自由基對細胞膜的破壞引起的溶血[4]。現代對金櫻子的化學成分和藥理作用研究雖多，其對人體表皮細胞抗衰老的相關研究卻甚少。本文以H2O2誘導的人角質形成細胞(HaCaT cell)為模型，研究不同濃度金櫻子提取液對HaCaT細胞增殖與凋亡作用的影響，并探討其抗氧化損傷作用與藥物濃度的關系，為今后金櫻子在延緩皮膚衰老的研究進程中提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人角質形成細胞(HaCaT cell)細胞株購自美國ATCC公司。

1.1.2 藥材 金櫻子果實購自廣州市大參林藥房。

1.1.3 儀器與試劑 旋轉蒸發儀(上海市貝侖儀器設備有限公司)；超凈工作臺(青島海爾公司)；5%CO2培養箱(美國Thermo公司)；-80 ℃低溫冰箱(美國Thermo公司)；酶熒光多功能檢測儀(美國Biotek公司)；細胞培養板(美國Falon公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；冷凍干燥機(日本Eyela公司)；離心機(Beckman Coulter公司)。CCK-8試劑盒(美國Biosharp公司)；Hochest33342試劑(美國Sigma公司)；30%H2O2試劑(天津市大茂化學試劑廠)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；10%胎牛血清(德國PAN Biotech公司)；PBS粉末(博士德生物)，其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 金櫻子提取液的制備 將金櫻子干燥果實去核，刮核毛，打粉40目篩。在105 ℃烘箱中干燥10 min得粗粉備用。精密量取金櫻子粗粉20 g，置500 mL圓底燒瓶中，加200 mL蒸餾水加熱回流1 h。趁熱抽濾得濾液1備用；向裝有濾渣的燒瓶中加入150 mL蒸餾水，加熱回流40 min，趁熱抽濾得濾液2。合并濾液1與濾液2，用旋轉蒸發儀將提取液濃縮至膏狀備用。將濃縮后的提取液用冷凍干燥機進行凍干處理，得到金櫻子提取物粉末。

1.2.2 H2O2誘導造模 CCK-8法篩選H2O2濃度的分組為：0、50、100、150、200、250、300 μmol·L-1，每組5個復孔。取培養好的HaCaT細胞，將原培養基吸出后分別加入對應體積的0.03% H2O2溶液和DMEM培養基使每孔體積為200 μL，于37 ℃、5%CO2培養箱內培養作用2 h(損傷造模)。換培養基繼續培養24 h，每孔分別加入5 μL CCK-8試劑作用3 h，充分染色后用酶標儀在450 nm波長下檢測OD值。細胞存活率通過以下公式計算：

存活率(%)=(OD處理/OD空白)×100%[10]

1.2.3 CCK-8染色法測定細胞增殖水平 以“1.2.2”項下篩選出的H2O2最佳濃度為基礎，實驗分為空白組、H2O2損傷組、藥物預處理組。空白組給予完全培養基；H2O2損傷組加入H2O2溶液使體系終濃度為最佳損傷濃度；藥物預處理組分為5個濃度計量組：1、5、10、15、20 μg·mL-1。先按濃度加入金櫻子提取物作用預處理2 h，再加入最佳濃度的H2O2溶液作用2 h對HaCaT細胞進行氧化損傷。換培養基終止反應后再在37 ℃、5% CO2培養箱中培育24 h，每孔分別加入5 μL CCK-8試劑作用3 h，充分染色后用酶標儀在450 nm波長下檢測OD值。計算每孔中細胞存活率。

1.2.4 Hochest染色觀察細胞凋亡 實驗分為空白組、H2O2損傷組、藥物預處理組(10 μg·mL-1)。通過Hochest33342染色來觀察最佳H2O2濃度下氧化損傷后及經過藥物預處理HaCaT細胞形態的變化及其凋亡情況。24孔板中的細胞經預處理及培養后，使用PBS緩沖液反復清洗3次，加入Hochest33342試劑染色30 min。使用光學顯微鏡觀察，并拍照。

2 結果

2.1 CCK-8染色法篩選H2O2氧化誘導HaCaT細胞最佳濃度 與空白組相比較，H2O2損傷組HaCaT細胞存活率(OD值)均有所下降，H2O2濃度100 μmol·L-1時差異有統計學意義(P<0.05)，隨著H2O2濃度升高，細胞存活率下降的趨勢逐步變小，100 μmol·L-1H2O2為氧化損傷適宜濃度，作為后續實驗損傷組中H2O2的加入量，結果見圖1。

圖1 不同濃度H2O2對HaCaT細胞生長的影響

2.2 CCK-8測定細胞增殖水平 與空白組比較，H2O2損傷組HaCaT細胞存活率明顯降低，與H2O2損傷組比較，各濃度藥物保護組HaCaT細胞存活率明顯升高，隨金櫻子提取液濃度升高，細胞存活率逐漸增大，具有統計學差異(P<0.05)，表明金櫻子提取液對氧化損傷后的HaCaT細胞有一定的保護作用，結果見圖2。

圖2 不同濃度金櫻子提取物對氧化損傷后細胞存活率的影響

2.3 Hochest染色觀察細胞凋亡情況 與空白組比較，H2O2損傷組細胞呈亮藍色，出現細胞核皺縮，染色質聚集的現象，凋亡細胞數量明顯增多，與H2O2損傷組比較，金櫻子提取液保護組細胞凋亡數量明顯減少，表明金櫻子提取液對氧化損傷后的HaCaT細胞凋亡有一定的抑制作用，結果見圖3。

A.空白組；B.H2O2處理組；C.金櫻子提取物作用組圖3 金櫻子提取物作用后HaCaT細胞凋亡情況

3 討論

近年來，隨著環境的惡化，皮膚健康問題越來越嚴重，各種因素都可以致使皮膚衰老，自由基氧化是引發皮膚衰老損傷的重要原因之一[5]。當機體遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)產生過多，導致氧化系統和抗氧化系統失衡，從而引起組織損傷，ROS 被認為是造成氧化應激的主要原因[6-7]，包括氧自由基和非自由基的含氧產物，如羥自由基(-OH)、超氧陰離子(O2-)、脂質過氧化物(ROO-、 RO-與ROOH)及過氧化氫(H2O2)等[8]。金櫻子果實中的水溶性多糖和總黃酮均具有良好的抗氧化能力，能消除超氧陰離子自由基，減輕自由基對細胞膜的破壞而引起的溶血[4]。金櫻子總黃酮可通過抑制凋亡和炎癥反應，防治H2O2的氧化損傷，也可顯著改善局部缺血再灌注造成的急性肝腎損傷[9]。H2O2易在機體內產生超氧自由基，從而破壞生物膜，引起DNA突變，破壞蛋白質的結構。有研究表明，H2O2能夠誘導細胞凋亡，使用低濃度的H2O2預處理后，細胞的凋亡率明顯增加[10]。體外H2O2能誘導并加速細胞因氧化應激損傷所致的衰老進程。因此，本研究以不同濃度的金櫻子提取液對HaCaT細胞進行預處理，CCK-8實驗結果表明不同濃度金櫻子提取液預處理2 h后，其細胞活力(OD值)有顯著提高，隨濃度升高細胞活力增強，表明金櫻子提取液對H2O2誘導的HaCaT細胞具有一定的增殖作用，且在一定濃度范圍內作用強度隨濃度升高而增大。Hochest染色法檢測金櫻子提取液對細胞凋亡的影響，結果顯示H2O2損傷組較空白組出現更多的細胞出現細胞核皺縮，細胞質聚集等典型的細胞凋亡特征，在藥物保護組中細胞凋亡現象明顯減少，表明金櫻子提取液可以抑制經H2O2氧化損傷造成的HaCaT細胞凋亡。綜上所述，金櫻子提取液對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化應激損傷具有一定的保護作用，其發揮抗氧化作用的機制還有待于進一步研究。