Th細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子在低體質(zhì)量先天性心臟病患兒肺血流異常發(fā)病機(jī)制中的作用

金立臣，溫林林，韓喆，張雪杰，姚俊平，宋海龍，陶曙光

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是嬰幼兒常見(jiàn)的缺陷性疾病，對(duì)新生兒危害較為嚴(yán)重，存活率相對(duì)較低[1]。近年來(lái)，隨著我國(guó)醫(yī)療環(huán)境的改善及CHD外科技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，多數(shù)患兒經(jīng)過(guò)手術(shù)治療可以得到較好的恢復(fù)，預(yù)后較好[2]。但對(duì)于低體質(zhì)量嬰幼兒，由于其機(jī)體免疫力低下、相關(guān)器官發(fā)育不成熟，病情較為復(fù)雜，容易引發(fā)免疫功能失調(diào)等各種并發(fā)癥[3]。CHD患兒本身存在一定程度的免疫功能紊亂和低下，即存在一定的Th1向Th2漂移[4]。Th1和Th2之間相互平衡在機(jī)體免疫機(jī)制中起著重要的作用，而轉(zhuǎn)錄因子在T細(xì)胞向Th1、Th2亞群進(jìn)行分化的過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]。而外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3 mRNA分別于Th1和Th2細(xì)胞中特異性表達(dá)[6]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CHD患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群的研究主要集中在代表Th1、Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子變化上，對(duì)Th細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)和研究甚少[7]。現(xiàn)觀察Th細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子在低體質(zhì)量CHD患兒肺血流異常發(fā)病機(jī)制中的作用，為其臨床診治提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年4月—2018年10月河北省兒童醫(yī)院心臟外科收治的低體質(zhì)量先天性心臟病患兒100例的臨床資料，根據(jù)患兒肺充血情況，分為肺充血組(n=62)和肺缺血組(n=38)。肺充血組男28例，女34例，月齡0.4～12(8.75±0.69)個(gè)月；體質(zhì)量2.85～8.63(5.62±1.54)kg；疾病類(lèi)型：動(dòng)脈導(dǎo)管未閉15例，房間隔缺損19例，室間隔缺損28例。肺缺血組男22例，女16例，月齡0.3～12(8.63±0.65)個(gè)月；體質(zhì)量2.78～8.71(5.71±1.52)kg；疾病類(lèi)型：肺動(dòng)脈狹窄15例，法洛四聯(lián)癥13例,其他10例。另取同期在醫(yī)院治療的其他疾病低體質(zhì)量患兒50例作為對(duì)照組，入院2周內(nèi)無(wú)呼吸道感染，其中男22例，女28例，月齡0.5～12(8.87±0.62)個(gè)月；體質(zhì)量2.69～8.60(5.82±1.68)kg；疾病類(lèi)型：隱睪15例，鞘膜積液21例，腹股溝斜疝14例。3組患兒性別、年齡、體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患兒家屬知情同意書(shū)并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 低體質(zhì)量診斷標(biāo)準(zhǔn):孕周26～40周,體質(zhì)量640～246 0 g；所有病例均經(jīng)體檢、輔助檢查及心臟彩色超聲確診為先天性心臟病；無(wú)肺、肝、腎等臟器嚴(yán)重病史；無(wú)嚴(yán)重感染、免疫性疾病史；入院時(shí)肝、腎功能均正常。排除合并有免疫缺陷者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 患兒于入院1 d內(nèi)采集肘靜脈血10 ml，加入EDTA 4 ml抗凝，通過(guò)聚蔗糖—泛影葡胺方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，并分離血漿2 ml備用[8]。

1.3.1 PCR法測(cè)定T-bet和GATA-3 mRNA表達(dá)[9]：上述PBMC細(xì)胞總mRNA采用Trizol法提取，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以確定所提取的mRNA完整性。cDNA合成按照逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)說(shuō)明書(shū)操作合成。RT-PCR檢測(cè)由ABI 7300 Real-Time PCR System(美國(guó)ABI公司)完成，PCR熱循環(huán)參數(shù)：96℃ 4 min，然后三步反應(yīng)：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的第三步即72℃ 30 s收集熒光信號(hào)，得到Ct值。用Δ Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并用RQ值比較各組的mRNA相對(duì)表達(dá)水平變化。引物設(shè)計(jì)：GATA-3上游引物5′-TCAGTTGCCTAAGTGGT-3′，下游引物5′-GCACGCTGGTAGCTCATACA-3′；T-bet上游引物5′-GGGACATGGGAGCAGAGA-3′，下游引物5′-TGGCGGGCTGATGGTTAT-3′；內(nèi)參基因hGAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGATTTC-3′。

1.3.2 血漿IL-4和IFN-γ水平測(cè)定：上述血漿采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定白介素4(IL-4)和γ干擾素(IFN-γ)水平，試劑盒購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.3.3 Th1/Th2細(xì)胞水平檢測(cè)[10]：取上述抗凝血1 ml，按照1∶1的比例與RPMI培養(yǎng)基進(jìn)行均勻混合，加入ionomyin 1 mg/L 和PMA 25 ng/L作為刺激原，同時(shí)將monensin 17 mg/L作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)4 h，對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行裂解，再加入DPBS緩沖液2 ml進(jìn)行1次沖洗，將上清液棄去，加入鼠抗人CD3-TC 20 μl和CD8-FITC 20 μl，在室溫條件下避光保存45 min；同時(shí)做陰性對(duì)照和空白對(duì)照，再進(jìn)行1次緩沖液清洗，離心5 min，將上清液棄去。再加入40 g/L多聚甲醛500 μl，固定20 min，離心5 min，將上清液棄去。然后將0.1%皂素緩沖液2 ml進(jìn)行破膜處理10 min，離心5 min，將上清液棄去。再用大鼠抗人IL-4單抗及大鼠抗人IFN-γ-PE，在室溫條件下孵育30 min，將0.1%皂素緩沖液2 ml加入其中，沖洗1次，離心5 min，將上清液棄去。最后用DPBS懸浮細(xì)胞(含20 g/L的多聚甲醛)500 μl，通過(guò)三色熒光流式細(xì)胞儀(NovoCyteTM型，貝克曼庫(kù)爾特)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 3組T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，肺充血組和肺缺血組T-bet和GATA-3 mRNA表達(dá)均明顯降低，且肺充血組患兒降低較肺缺血組更為顯著(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組患兒外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)水平比較拷貝/μg)

2.2 3組血漿IL-4、IFN-γ水平比較 與對(duì)照組比較，肺充血組和肺缺血組血漿IFN-γ均明顯降低，血漿IL-4明顯升高，且肺充血組患兒上述指標(biāo)變化較肺缺血組更為顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 3組患兒血漿IL-4、IFN-γ水平比較

2.3 3組Th1、Th2細(xì)胞百分率及Th1/Th2比率比較 與對(duì)照組比較，肺充血組和肺缺血組Th1細(xì)胞百分率和Th1/Th2比率均明顯降低，Th2細(xì)胞百分率明顯升高，且肺充血組患兒上述指標(biāo)變化較肺缺血組更為顯著(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 3組患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群Th1、Th2細(xì)胞百分率比較

2.4 CHD患兒T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)水平與血漿IL-4、IFN-γ水平的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，CHD患兒T-bet mRNA表達(dá)與血漿IL-4呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.764/0.000)，與IFN-γ水平呈正相關(guān)(r/P=1.258/0.005);GATA-3 mRNA表達(dá)與血漿IL-4呈正相關(guān)(r/P=0.513/0.015),與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.525/0.032)。

2.5 CHD患兒T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)水平與外周血淋巴細(xì)胞亞群Th1、Th2細(xì)胞相關(guān)分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，CHD患兒T-bet mRNA表達(dá)與Th1百分率呈正相關(guān)(r/P=0.685/0.027)，與Th2百分率呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.985/0.002)；GATA-3 mRNA表達(dá)與Th1百分率呈負(fù)相關(guān)(r/P=-0.652/0.025)，與Th2百分率呈正相關(guān)(r/P=0.793/0.011)。

3 討 論

初始T淋巴細(xì)胞接受抗原刺激信號(hào)，在共刺激分子和共刺激信號(hào)的作用下發(fā)生活化，進(jìn)而在不同條件下分化成調(diào)節(jié)型T淋巴細(xì)胞、Th17型、Th2型及Th1型效應(yīng)細(xì)胞等不同亞型，執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能[11]。其中Th2細(xì)胞主要分泌IL-13、IL-10、IL-6、IL-5、IL-4等細(xì)胞因子，主要對(duì)B淋巴細(xì)胞的活化和增殖進(jìn)行刺激，同時(shí)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，與機(jī)體體液免疫關(guān)系較為密切[12]。Th1細(xì)胞主要分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2等細(xì)胞因子，在機(jī)體遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)的形成及細(xì)胞免疫過(guò)程中起著重要的作用[13]。Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞之間存在相互調(diào)節(jié)和制約的作用，兩者平衡失調(diào)會(huì)引發(fā)不同的免疫紊亂，與其他相關(guān)細(xì)胞因子致使先天性心臟病等免疫性疾病的發(fā)生[14]。本研究通過(guò)對(duì)各組受試者的外周血淋巴細(xì)胞分泌相應(yīng)細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，CHD患兒外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的水平降低，分泌IL-4能力增強(qiáng)，間接反映了CHD患兒Th2型細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1型細(xì)胞功能不足。

前體T細(xì)胞受到激素、黏附分子、局部微環(huán)境、抗原提呈細(xì)胞類(lèi)型及抗原類(lèi)型和濃度等作用，向Th1和Th2細(xì)胞分化，是機(jī)體化學(xué)信號(hào)作用于其表面特異性受體后，通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)相應(yīng)特征性細(xì)胞因子譜進(jìn)行選擇性表達(dá)的一個(gè)過(guò)程[15-16]。近期研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet分別與Th2細(xì)胞因子基因和IFN-γ基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，對(duì)Th2和Th1兩類(lèi)細(xì)胞的發(fā)育和分化起到中心調(diào)節(jié)作用[17]。T-bet是轉(zhuǎn)錄因子T盒家族的成員之一，可特異性表達(dá)于Th1細(xì)胞，是其分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[18]。有研究顯示，對(duì)小鼠T-bet基因進(jìn)行敲除后，小鼠可表現(xiàn)出類(lèi)似于CHD的病理性免疫改變[19]。GATA-3是鋅指蛋白GATA家族的主要成員之一，可以誘導(dǎo)Th前體向Th2細(xì)胞分化，是其分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[20]。相關(guān)研究顯示，對(duì)小鼠GATA-3進(jìn)行敲除后，由Th2細(xì)胞分化的相應(yīng)細(xì)胞因子水平降低[21]。總之，T-bet對(duì)Th1細(xì)胞發(fā)育起到正調(diào)控作用，GATA-3也對(duì)Th2細(xì)胞的發(fā)育起到正調(diào)控作用，兩者對(duì)Th0向Th1/Th2的轉(zhuǎn)化進(jìn)行調(diào)節(jié)[22]。另外，GATA-3和T-bet可形成一種自我激活的反饋型調(diào)節(jié)環(huán)路，針對(duì)相關(guān)特異性轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而形成一種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)型網(wǎng)絡(luò)[23]。本研究結(jié)果顯示，CHD患兒PBMC細(xì)胞GATA-3 mRNA表達(dá)水平明顯升高，T-bet mRNA表達(dá)水平明顯降低。相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，CHD患兒T-bet mRNA表達(dá)與血漿IFN-γ水平、Th1百分率呈正相關(guān)，GATA-3 mRNA表達(dá)與血漿IL-4水平、Th2百分率呈正相關(guān)。結(jié)合相應(yīng)研究結(jié)果，可知GATA-3和T-bet表達(dá)平衡失調(diào)在Th前體細(xì)胞向Th1/Th2細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要調(diào)控作用，進(jìn)而影響血漿IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子的分泌，參與CHD發(fā)病。

綜上所述，GATA-3和T-bet表達(dá)平衡失調(diào)對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的平衡偏移具有重要的調(diào)控作用，從而影響血漿IFN-γ、IL-4水平，在CHD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

金立臣：提出研究方向、研究思路，論文撰寫(xiě)，論文審核；溫林林：分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);韓喆：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理，論文修改；張雪杰、宋海龍：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，設(shè)計(jì)論文框架;姚俊平：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理；陶曙光：設(shè)計(jì)研究方案、研究流程