Smad核相互作用蛋白1在白細胞介素-1β誘導骨關節炎中的作用及機制實驗研究

梁小弟，梁小菊，李芙蓉，石茂才

(1.定西市人民醫院骨二科，甘肅 定西 743000；2.西安交通大學附屬紅會醫院小兒骨科，陜西 西安 710054；3.定西市人民醫院麻醉科，甘肅 定西 743000)

骨關節炎是一種以關節軟骨退化和關節炎癥為特征的關節退行性疾病[1-2]。骨關節炎是由年齡、性別、肥胖、遺傳等系統因素與局部因素相互作用的復雜結果[3-4]。軟骨細胞負責細胞外基質的合成和周轉，對關節功能至關重要[5]。Smad核相互作用蛋白1(Smad nuclear interaction protein 1，SNIP1)是一個抑炎蛋白，已有研究表明白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)處理可顯著降低腸上皮細胞中SNIP1的表達，且SNIP1有助于降低腸上皮細胞的炎癥反應[6]。在小鼠胚胎腎293細胞中，SNIP1抑制炎癥通路NF-κB的表達[7]。過表達SNIP1還可以減弱了miR-335對骨肉瘤細胞的抑制作用[8]。本文主要目的是研究SNIP1對 IL-1β 誘導的骨關節炎軟骨細胞的炎癥反應及其分子機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人膝關節軟骨細胞NHAC-κn(ATTC，美國)；DMEM-F12培養基(ThermoFisher，No.11320-033)；胎牛血清(Thermo Fisher，No.10099158)；脂質體3000(Invitrogen公司，美國)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(Takara，日本)；蛋白提取試劑盒(南京建成生物技術有限公司)；抗一氧化氮合酶(iNOS)抗體、抗環氧合酶-2(COX-2)抗體、抗Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)抗體、抗基質金屬蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase 13，MMP-13)抗體、抗MMP-3抗體、抗聚集蛋白聚糖(Aggrecan)抗體、抗磷酸化細胞核因子-κBp65(NF-κB p-p65)抗體、抗磷酸化核因子抑制蛋白(p-IκB)抗體、抗GAPDH抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)二抗 (稀釋比為1∶5000)購自英國Abcam公司；ELISA檢測試劑盒購自美國Abcam公司。

1.2 實驗儀器 低溫高速離心機和多功能酶標儀(Thermo Fisher，美國)，熒光定量PCR儀、分光光度計(Bio-Rad，美國)，凝膠成像系統(ABI，美國)，全自動化學發光分析儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養及處理：在DMEM細胞培養基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)中培養NHAC-κn，將培養基置于含5% CO2的37 ℃培養箱中。按照 Lipfectamine 3000說明書，取對數生長期的NHAC-κn細胞進行轉染。用IL-1β(0、5、10、20 ng/ml)處理NHAC-κn 24 h構建骨關節炎細胞模型。NHAC-κn細胞被分為未處理組(untreated)、空白對照組(IL-1β)、空載體組(IL-1β+pcDNA3.1)、 過表達組(IL-1β+pcDNA3.1-SNIP1)。

1.3.2 CCK-8法測定細胞活性：將轉染成功的5×103/ml NHAC-κn細胞在96孔板上培養24 h后，在每個孔中加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃培養4 h，用酶標儀檢測450 nm的吸光度。

1.3.3 一氧化氮(NO)含量的測定：將細胞(3×105/ml)接種于6孔板培養，24 h后用Griess反應測定NO濃度。在543 nm波長下測量每個樣品的吸光度。

1.3.4 RNA檢測SNIP1表達：用TRIzol試劑將總RNA從軟骨細胞中分離出來，并反轉錄成單鏈cDNA。采用10 μl PCR反應體系，包含4.5 μl稀釋cDNA，0.25 μl正向引物，0.25 μl反向引物和5 μl SYBR Green Mix。引物序列物如下：SNIP1 F/R：5’-TGCGGTCTTTCAATATCGGC-3’，5’-AGAAGGTTCCATTGCCTGAGC-3’；GAPDH F/R：5’-GGGAAACTGCGGCGTGAT-3’，5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。GAPDH為內參基因。用 2-ΔΔCT法表示基因的相對表達量。

1.3.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA):采用ELISA法測定細胞培養上清液中一氧化氮(Nitric oxide，NO)，前列腺素E2(PGE2)，白細胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度。具體實驗方法如下：將特異性抗體用包被緩沖液稀釋至最適濃度(1～10 μg/ml)，37 ℃水浴3 h。移去包被液，用洗滌緩沖液(含0.05 %Tween-20)洗3次，每次5 min。每孔加入0.2 ml含抗原的被檢標本，37 ℃處理1～2 h。加入0.2 ml酶標記特異性抗體溶液，37 ℃處理1～2 h。移去包被液，用洗滌緩沖液(含0.05 %Tween-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 ml底物溶液于每個孔(OPD或OT)，室溫作用30 min。加終止劑：每孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。用酶標比色計測定OD(492 nm)值。以上實驗重復3次，取平均值。

1.3.6 免疫印跡分析法蛋白表達：用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液從軟骨細胞中提取總蛋白， BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白在SDS-PAGE中被分離，然后被轉移至PVDF膜并在含5%脫脂牛奶的TBST封閉緩沖液孵育2h。加入一抗(1∶1000稀釋)在4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，用含0.1% Tween-20的TBS洗滌3次，每次5 min，再與二抗(1∶5000稀釋)一起孵育膜2 h。最后，用增強型化學發光試劑盒檢測蛋白，并用Quantity ONE(BioRad, Hercules, CA, USA)軟件進行定量。GAPDH作為內參蛋白。

2 結 果

2.1 IL-1β處理下調SNIP1表達 見圖1。研究發現，24 h的IL-1β(0、5、10、20 ng/ml)處理明顯降低NHAC-κn細胞活性(P<0.05，圖1A)；SNIP1的mRNA和蛋白表達水平也隨著IL-1β的濃度上升而下降(P<0.05，圖1B、C)。鑒于20 ng/ml IL-1β處理組NHAC-κn活性過低，因此選擇10 ng/ml IL-1β處理NHAC-κn細胞24 h進行后續相關實驗。

2.2 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β誘導的NHAC-κn細胞中的炎癥因子的表達 見圖2。pcDNA3.1-SNIP1轉染NHAC-κn細胞后，SNIP1表達顯著提高(P<0.05)(見圖2A﹑B)。利用ELISA法檢測IL-1β誘導的NHAC-κn細胞中NO、PGE2、IL-6、TNF-α的含量，分析SNIP1對IL-1β誘導的NHAC-κn細胞中炎癥反應的影響。過表達SNIP1的NHAC-κn細胞中NO、PGE2、IL-6、TNF-α含量均顯著低于未轉染組(P<0.05，見圖2C～F)。

2.3 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β誘導的NHAC-κn細胞中iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5的表達 通過免疫印跡分析實驗，表達SNIP1顯著抑制IL-1β誘導的NHAC-κn細胞炎癥反應中炎癥介質(COX-2、iNOS)與分解代謝因子(MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5)的合成(P<0.05)，見圖3。

2.4 pcDNA3.1-SNIP1促進IL-1β誘導的NHAC-κn細胞中Collagen Ⅱ和Aggrecan的表達 見圖4。結果顯示，IL-1β處理顯著抑制NHAC-κn細胞外基質成分Collagen Ⅱ和Aggrecan的表達，過表達SNIP1可部分逆轉IL-1β的抑制作用(P<0.05)。

2.5 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β誘導的NF-κB p65和 IκB 磷酸化 見圖5。為探究SNIP1影響IL-1β誘導的NHAC-κn細胞的分子機制，我們用蛋白印跡法檢測了p-p65、p-IκB的表達。pcDNA3.1-SNIP1顯著抑制NF-κB通路，Betulinic acid可逆轉pcDNA3.1-SNIP1對p-p65、p-IκB蛋白水平的抑制作用，且可緩解SNIP1對炎癥因子(IL-6、TNF-α)的抑制作用(P<0.05)。

注：與未處理組比較，*P<0.05

注：與未處理組比較，*P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1組比較，#P<0.05

3 討 論

骨關節炎是一種慢性退行性關節疾病，其特征是軟骨基質的逐漸喪失和關節軟骨的破壞。隨著時間的推移，軟骨下骨增厚，滑膜內產生各種炎癥介質，最后，膝關節韌帶和半月板的退化導致關節囊肥大[9]。探索骨關節炎的治療靶標對于改善患者的臨床癥狀并提高其生活質量具有重要意義。

SNIP1在多種細胞和組織中均有表達，可調節不同的生物學進程[10- 11]。例如，SNIP1在炎性腸病患者的外周血單核細胞和固有層單核細胞中的表達均顯著下調[12]。在活動性克羅恩病和潰瘍性結腸炎患者的黏膜上皮細胞中，SNIP1的表達也顯著降低，并使腸上皮細胞屏障功能受損[6]。在本實驗中，我們用10 ng/mlIL-1β處理NHAC-κn細胞24 h來構建骨關節炎的細胞模型，結果顯示SNIP1的mRNA和蛋白的表達水平均下調。

注：與未處理組比較，*P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1組比較，#P<0.05

注：與未處理組比較，*P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1組比較，#P<0.05

注：與未處理組比較，*P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1組比較，P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1-SNIP1組比較，#P<0.05

IL-1β誘導iNOS產生過量的NO，從而刺激產生MMPs和PGE2等炎性細胞因子，并抑制膠原蛋白和蛋白多糖的合成[13]。PGE2能通過增強MMPs和其他炎性細胞因子活性介導軟骨基質的降解[14]。越來越多的證據表明，抑制NO和PGE2等炎癥介質的產生能夠緩解骨關節炎[15]。在本研究中，我們發現過表達SNIP1顯著抑制IL-1β誘導產生的NO、PGE2、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5，并促進Collagen Ⅱ和Aggrecan的合成，表明SNIP1可能緩解IL-1β處理導致的軟骨細胞炎性反應。

NF-κB信號通路是參與骨關節炎發病機制的主要分解代謝信號通路之一，在調節與骨關節炎相關的炎癥介質中起著關鍵作用[16]。炎癥介質如IL-1β刺激使NF-κB從細胞質進入細胞核，促進多種炎癥相關基因(iNOS、COX-2、PGE2和MMPs)的表達上調，從而促進軟骨細胞中產生分解代謝因子，導致軟骨炎癥[17]。在本實驗中，我們發現過表達SNIP1抑制p-p65和p-IκB的表達，且NF-κB激活劑可逆轉pcDNA3.1-SNIP1對炎癥因子(IL-6、TNF-α)的抑制作用，提示SNIP1通過抑制NF-κB通路緩解軟骨細胞的炎癥反應。

本研究表明，在10 ng/ml IL-1β處理的NHAC-κn細胞中，SNIP1表達顯著降低。過表達SNIP1會抑制炎癥反應產生的NO、PGE2、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5水平，促進Collagen Ⅱ和Aggrecan合成。此外，SNIP1抑制NF-κB通路，NF-κB激活劑可以部分逆轉SNIP1對骨關節炎的抑制作用。綜上，SNIP1可能通過抑制NF-κB通路緩解骨關節炎，為探索骨關節炎的機理及治療方法提供了理論基礎。