產超廣譜β-內酰胺酶腸桿菌致呼吸機相關性肺炎與自然殺傷細胞、T細胞亞群相關性和危險因素分析

杜蘇豐，孫萬里，郭新成

(1.西安市胸科醫院結核內科，陜西 西安 710100；2.西安市胸科醫院重癥醫學科，陜西 西安 710100；3.漢中市中心醫院重癥醫學科，陜西 漢中 723000)

呼吸機相關性肺炎(Ventilator associated pneumonia，VAP)是一種嚴重的醫院獲得性肺炎，為患者機械通氣治療中常見的并發癥。其發病主要與機械通氣或外源性氣管插管有關[1-2]。危重癥患者常有多種侵入性操作史，機體長期處于應激狀態，引起代謝異常、機體營養水平低下、免疫水平降低，使感染發生幾率大大增加[3]。機械通氣易引起患者發生VAP，其發病率高、病死率高[4]，嚴重影響患者的身心健康。

隨著抗生素的廣泛使用，腸桿菌、銅綠假單胞菌以及鮑曼不動桿菌等病原菌的耐藥性日益嚴重[5]。腸桿菌是目前VAP中最常見的病原菌之一，其耐藥機制主要與產生超廣譜β-內酰胺酶(Extended spectrum beta-Lactamase,ESBLs)有關，對產ESBLs 腸桿菌所致的各類感染疾病為亟待解決的問題[6]。自然殺傷(Natural killers，NK)細胞是一種淋巴細胞，為機體免疫系統第一道防線，能發揮重要的細胞毒性效應快速消滅靶細胞，有研究表明，NK細胞數量對肺炎的預后有重要指導意義[7]。T細胞亞群是極為重要的參與細胞免疫的細胞群，以 CD4+、CD8+為代表，多種感染性和免疫性疾病常以二者比值對細胞免疫狀態進行評估[8]。本研究通過對ESBLs-VAP患者NK細胞和T細胞亞群動態變化進行檢測分析，并對引起ESBLs-VAP的危險因素進行研究，以期為臨床提供一定依據，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以90例2016年2月至2020年3月收入的重癥肺炎行機械通氣發生VAP患者為研究對象，以感染ESBLs腸桿菌 VAP患者為研究組，共28例，以未感染ESBLs腸桿菌 VAP患者為對照組，共62例。患者一般資料如表1所示，兩組患者年齡、性別、發生VAP時間、通氣時間及住院時間等一般資料經比較分析差異無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。患者及家屬均充分了解研究內容并簽署知情同意書，本研究已獲得醫院倫理委員會的準許。病例納入標準：①符合《呼吸機相關性肺炎診斷、預防和治療指南》中關于VAP的診斷標準；②患者使用呼吸機通氣48 h后所發生的肺炎；③胸部 X 影像學檢查顯示可見新發生的或表現為進展性的浸潤陰影；④氣管和支氣管內有膿性分泌物出現；患者體溫>38.0 ℃或<36.0 ℃；患者外周血白細胞>10.0×109/L 或<4.0×109/L。排除標準：①資料不完全者；②機械通氣時間未達到48 h；③機械通氣<48 h前痰培養檢查顯示有病原菌者；④無法自主呼吸，需使用呼吸機維持生命者；⑤氣管插管后短期死亡者；⑥有應用大劑量糖皮質激素、免疫抑制劑或免疫增強劑史者。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 T淋巴細胞亞群檢測：所有患者均于入住ICU時、機械通氣48 h及第7天抽取肘靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管中。于實驗管中分別加入20 μl鼠抗人特異性單克隆抗體(PerCP-CD3、PE-CD8及FITC-CD4)，再加入100 μl靜脈血，在漩渦混勻器上進行混勻，在4 ℃避光條件下孵育30 min。再加入溶血素2 ml，混勻室溫下避光8 min以使紅細胞充分裂解，離心分離(1500 r/min,5 min)，棄去上清液，加入PBS液1 ml進行洗滌，以多聚甲醛液固定。使用流式細胞儀測定樣本中CD4+T以及CD8+T淋巴細胞在CD3+T淋巴細胞中的比例。

1.2.2 NK細胞檢測：所有患者均于入住ICU時、機械通氣48 h及第7天抽取肘靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管中。于實驗管中加入20 μl鼠抗人特異性單抗(FITC-CD3和PE-CD56+CD16)，再加入100 μl新鮮靜脈血，在漩渦混勻器上進行混勻，在4 ℃避光條件下孵育30 min。再加入溶血素2 ml，混勻，室溫下避光8 min以使紅細胞充分裂解，離心分離(1500 r/min,5min)，棄去上清液，加入PBS液1 ml進行洗滌，以多聚甲醛液固定，4 ℃固定30 min。使用流式細胞儀測定樣本中NK 細胞在淋巴細胞中占比。

1.2.3 危險因素分析：對所有患者一般情況、實驗室檢查、治療情況等進行統計分析。一般情況包括性別、年齡、住院時間、基礎疾病(糖尿病、冠心病、肺部基本疾病以及惡性腫瘤等)等。實驗室檢查包括患者白蛋白水平、痰培養、藥敏試驗等。治療情況包括抗生素使用情況(種類和時間)、患者機械通氣時間、患者意識情況等。

2 結 果

2.1 兩組患者不同時間NK細胞比例比較 與對照組相比，研究組患者NK細胞比例在干預前差異無統計學意義(P>0.05)，在第2天和第7天均顯著降低(P<0.05)；相比于干預前的基線值，第2天時兩組NK細胞比例均顯著降低(P<0.05)，第7天時兩組NK細胞比例顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者不同時間NK細胞比例比較(%)

2.2 兩組患者不同時間T細胞亞群比較 與對照組相比，研究組患者CD4+T細胞比例在干預前、第2天和第7天差異無統計學意義(均P>0.05)，CD8+T細胞占比在干預前和第2天差異無統計學意義(均P>0.05)，第7天時顯著升高(P<0.05)；相比于干預前基線值，兩組患者CD4+T細胞占比在第2天和第7天均無明顯波動(P>0.05)，兩組患者CD8+T細胞占比在第2天無明顯波動(P>0.05)，研究組在CD8+T細胞占比第7天時升高顯著(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者不同時間T細胞亞群比較(%)

2.3 ESBLs-VAP 危險因素的單因素分析 患者性別、年齡和糖尿病不會使ESBLs-VAP風險增加(均P>0.05)；但患有肺部基礎疾病、白蛋白水平、患者意識障礙、機械通氣時間>5 d、應激性高血糖、抗生素>2種、抗生素天數在兩組比較中差異有統計學意義(均P<0.05)，是引起ESBLs-VAP的危險因素。見表4。

表4 兩組ESBLs-VAP單因素分析

2.4 ESBLs-VAP 危險因素的多因素分析 根據單因素分析結果，對肺部基礎疾病、白蛋白水平、患者意識障礙、機械通氣時間>5 d、應激性高血糖、抗生素>2種、抗生素天數這幾種因素進行Logistic回歸分析，結果見表5所示。表明肺部基礎疾病、白蛋白水平、患者意識障礙、機械通氣時間>5 d、應激性高血糖、抗生素>2種可作為ESBLs-VAP的獨立危險因素。

表5 ESBLs-VAP多因素回歸分析

3 討 論

隨著臨床上抗生素的廣泛使用，致病菌對抗β-內酰胺類菌藥物的耐藥性日益加重，特別是ESBLs細菌的產生，給臨床治療帶來很大的挑戰。ESBLs主要由大腸桿菌以及肺炎克雷伯菌產生，亦可由沙門菌屬、檸檬酸桿菌屬等細菌產生[9-11]。產ESBLs腸桿菌均能發生垂直傳播，同時ESBLs腸桿菌中的酶還能通過質粒傳播給同科其他細菌，極容易導致交叉感染及耐藥菌擴散，因此有必要對ESBLs菌所致VAP的機制進行研究[12-13]。

本研究對ESBLs-VAP患者外周血中NK細胞在淋巴細胞中的占比進行研究分析，結果顯示，與對照組相比，研究組患者NK細胞比例在干預前差異無統計學意義(P>0.05)，在第2天和第7天均顯著降低(P<0.05)；相比于干預前的基線值，第2天時兩組NK細胞比例均顯著降低(P<0.05)，第7天時兩組NK細胞比例顯著升高(P<0.05)。NK細胞是人體免疫系統第一道防線，參與了機體適應性免疫和固有免疫反應，能在感染初期發揮重要的細胞毒效應消滅靶細胞NK 細胞，也對不成熟的樹突狀細胞有殺傷作用，也可通過分泌 IFN-γ和TNF-α以促進樹突狀細胞的成熟，再依靠與樹突狀細胞的交互作用使其向T細胞的抗原遞呈效應增強，嚴重感染可引起外周血中NK細胞明顯減低[14]。

本研究對兩組CD4+T和CD8+T細胞占CD3+T細胞比例進行檢測分析，結果表明，與對照組相比，研究組患者CD4+T細胞比例在干預前、第2天和第7天均差異無統計學意義(P>0.05)，CD8+T細胞占比在干預前和第2天差異無統計學意義(P>0.05)，第7天時顯著升高(P<0.05)；相比于干預前基線值，兩組患者CD4+T細胞占比在第2天和第7天均無明顯波動(P>0.05)，兩組患者CD8+T細胞占比在第2天無明顯波動(P>0.05)，研究組在CD8+T細胞占比第7天時升高顯著(P<0.05)。T細胞亞群以CD3+為代表，是重要的免疫細胞類群，參與機體細胞免疫；輔助/誘導T細胞以CD4+為代表，抑制/細胞毒性T細胞以CD8+為代表，常用二者對免疫和感染性疾病的細胞免疫狀態進行評估[8]。危重癥患者術后存在創傷應激狀態，患者免疫功能紊亂，出現免疫力下降，免疫應答減弱，表現為CD4+T減少，CD8+T增加，進而引起使免疫失衡，導致嚴重感染發生[15]。

本研究采用單因素分析對可能引起ESBLs-VAP的危險因素進行研究，結果顯示患者性別、年齡和糖尿病不會使ESBLs-VAP風險增加(P>0.05)；但患有肺部基礎疾病、白蛋白水平、患者意識障礙、機械通氣時間>5 d、應激性高血糖、抗生素>2種、抗生素天數在兩組比較中差異有統計學意義(P<0.05)，是引起ESBLs-VAP的危險因素。根據單因素分析結果，對上述幾種因素進行Logistic 回歸分析，結果表明肺部基礎疾病、白蛋白水平、患者意識障礙、機械通氣時間>5 d、應激性高血糖、抗生素>2種可作為ESBLs-VAP的獨立危險因素。患者存在的慢性肺部基礎疾病易引起肺部結構和功能的改變，且因長期使用抗生素等，免疫力低下，感染率增加。血清白蛋白降低表示患者營養狀況較差，對呼吸系統肌肉功能有一定損害，增加呼吸衰竭及感染風險[16]。存在意識障礙的患者多有活動受限，自主嗆咳反應弱，易使口咽部及胃內容物發生誤吸入肺內，使ESBLs-VAP發生率明顯升高[17]。機械通氣會損傷呼吸道正常的防御功能，降低其細菌清除功能，易誘發肺部感染。應激性高血糖使血液處于高滲狀態，引起血管通透性的改變，影響中性粒細胞的趨化、吞噬能力，增加ESBLs-VAP風險[18]。使用2種以上的抗生素易引起腸源性的感染，使腸道菌群失調，損傷腸道的屏障功能，使耐藥菌從多種途徑進入呼吸道發生肺部感染[19]。

綜上所述，ESBLs-VAP的發生與NK細胞、T細胞亞群的改變有關，肺部基礎疾病、白蛋白水平等因素是其獨立預測因素。