美沙拉秦長期治療對潰瘍性結腸炎患者結腸黏膜癌相關基因表達的影響

安 敏，高振軍

(復旦大學附屬中山醫院青浦分院消化科，上海 210007)

流行病學研究[1-2]顯示，與正常人群相比較，潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)患者癌癥的風險高出5.7倍，疾病診斷后10年、20年、30年結直腸癌累積發生率分別為1.6%、8.3%和18%。5-氨基水氧酸(5-Aminosalicylic acid，5-ASA)是治療UC及維持輕中度UC患者緩解的常用藥物，研究顯示，5-ASA和磺胺嘧啶可顯著降低UC患者大腸癌發生風險[3-4]。薈萃分析[5]顯示，口服1.2 g/d ASA的UC患者大腸癌發生優勢比為0.551，在更高劑量下可降低至0.23。雖然多項研究表明長期服用5-ASA具有抗腫瘤作用，但5-ASA對UC的治療和化學預防機制仍不明確。在嚙齒類大腸癌模型中，5-ASA可抑制腫瘤生長并減少異常隱窩病灶數量[6]。5-ASA已在幾種不同的大腸癌(Colorectal cancer，CRC)細胞系中以時間和劑量依賴的方式顯示生長抑制和凋亡誘導作用。在文獻報道的由氨基水楊酸調節的靶點中，目前研究較多的包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、核因子-κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Wnt/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)途徑以及環氧化酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)，但5-ASA調節腫瘤進展的確切分子靶點和途徑尚未完全明確[7-8]。缺乏β-catenin或COX-2或具有突變形式的CRC細胞系也會對5-ASA的暴露產生反應，表現為細胞周期停滯或凋亡或腫瘤形成能力下降，提示在5-ASA的作用機制中涉及替代途徑，并且5-ASA的抗炎作用與細胞培養模型中的抗癌作用一致[9-10]。在早期的一項研究中，5-ASA在LS180結腸癌細胞系中抑制了TC22和一種與CRC相關的新型原肌球蛋白亞型[11]。因此，5-ASA的潛在抗癌作用部分歸因于與阿司匹林的結構相似，并可能由PPARγ和NF-κB p65介導。本研究選擇既往文獻報道中與致癌和炎癥相關的基因進行觀察，旨在了解長期使用美沙拉嗪后結腸組織的分子變化為臨床相關濃度下5-ASA的化學預防作用提供臨床數據支持，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集在青浦區中山醫院青浦分院接受長期美沙拉秦治療的61例UC患者作為研究對象，病例納入標準：①患者年齡18～65歲，性別不限；②持續性或反復發作性黏液血便、腹痛伴有不同程度全身癥狀，聯合腸鏡和(或)黏膜活檢確診為UC，病情嚴重程度輕、中度；③持續服用美沙拉秦≥2年；對研究知情并簽署知情同意書。排除標準：重度UC；采用≥20 mg以上類固醇激素治療者；合并嚴重心、肝、腎功能不全者；既往有胃腸道手術史者；合并惡性腫瘤患者；孕期或哺乳期婦女；精神疾病或嚴重認知功能障礙者；擬納入或已納入其他臨床研究者。共納入患者61例，其中男39例，女22例；年齡23～61歲，平均(41.83±11.566)歲；病程3～12年，平均(5.38±2.46)年；病變范圍：全結腸炎37例，左側結腸炎25例。

1.2 研究方法 患者每天服用1.5～3.0 g美沙拉秦(批號：080328)維持治療，藥物劑量由臨床醫師根據病情判定。治療前和治療2年時給予結腸鏡檢查，活檢標本取自直腸、乙狀結腸，標本分為兩份，一份用福爾馬林固定進行病理分級 ，另一份-80 ℃快速冷凍用于聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR),分析。基線和2年時評估患者的Mayo活動指數(Mayo AI)，Mayo AI包括大便頻數、血便、醫師評分和黏膜表現等4個條目，每個條目以4級法進行評分，分別得分0～3分，其中黏膜表現參照內窺鏡檢查結果：0分表示正常和靜止性炎癥，1分表示輕度炎癥，2分表示中度炎癥，3分表示嚴重炎癥，可伴自發性出血、潰瘍等表現。組織病理學評分根據Nancy組織病理學評分進行病理分級，分為0～3分，分別代表無活動性炎癥、輕度活動性炎癥、中度活動性炎癥和重度活動性炎癥。隨訪時Mayo AI≤1分定義為顯效，Mayo AI或組織病理學評分降低≥1分定義為有效，否則定義為無效，顯效加有效定義為治療有效。

1.3 RT-PCR檢測 用羅氏Lightcycler和Qiagen SYBR綠色PCR試劑盒進行實時RT-PCR。所有樣品在95 ℃下變性45 s，然后在62 ℃和72 ℃下分別進行30個擴增周期，每次10 s和12 s。以β-actin為內對照，用檢測引物對兩份樣品進行檢測。通過使用2-ΔΔCt方法將測試樣品的閾值(Ct)與肌動蛋白(β-actin，內部對照)的Ct值標準化。基因引物見表1。治療前后基因變化率=(治療后基因相對表達量-治療前基因相對表達量)/治療前基因相對表達量×100%。

表1 相關基因引物序列

2 結 果

2.1 患者臨床特征和美沙拉秦治療后病情變化 61例患者隨訪時病情緩解(Mayo AI≤1分)30例，活動期UC(Mayo AI>1分)31例；服用美沙拉嗪1.5 g/d者34例，3.0 g/d者27例，1.5 g/d和3.0 g/d美沙拉秦患者臨床療效均無統計學差異(82.35%與77.78%,χ2=0.199，P=0.655)；根據Mayo AI評分有49/61例(80.33%)患者被歸于治療有效。根據組織病理學檢查，38/61例(62.30%)患者的組織病理學有所改善，17/61例患者保持不變，6/61例(9.84%)出現組織病理學惡化(炎癥程度增加)。

2.2 患者治療前后結腸黏膜相關基因表達水平比較 治療后患者細胞增殖核抗原(Ki-667)、癌胚抗原相關細胞粘附分子1(CEACAM-1)、BCL2L1、P53、CXC趨化因子配體10(CXCL10)、PPAR-γ、NF-κB mRNA相對表達水平均較治療前顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；治療后患者細胞分裂周期因子25A(CDC25A)、CTNNB1、COX-2、白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平均低于治療前，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 患者治療前后結腸黏膜癌相關基因表達水平比較

續表

2.3 患者治療前后Mayo AI評分和Nancy組織病理評分比較 治療后患者Mayo AI評分和Nancy組織病理評分均較治療前顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 患者治療前后Mayo AI評分和Nancy組織病理評分比較(分)

2.4 變量與美沙拉秦用藥時間的多元線性回歸結果 以治療前后變量為應變量，將性別、年齡、病變部位、病程、治療前Mayo AI評分、Nancy組織病理評分、美沙拉秦劑量、美沙拉秦治療時間等變量引入多元線性回歸，結果顯示，藥物應用時間與Ki-67、NF-κB、PPAR-γ、COX-2、IL-8、CXCL10、CDC25A基因變化率顯著相關(P<0.05)。見表4。

表4 變量與美沙拉秦用藥時間的多元線性回歸結果

3 討 論

臨床研究表明柳氮磺胺吡啶和5-ASA對UC具有抗癌作用，但這些作用的分子機制尚未完全闡明。本研究的目的是測量長期5-ASA治療對UC患者結腸活檢組織中致癌相關基因表達的影響，從而為5-ASA的化學預防作用提供分子基礎。既往研究[12]顯示，NF-κB(p65)、PPAR-γ、COX-2、CXCL10、TNF-α、IL-8、CDC25A、p53等基因參與介導5-ASA對結直腸細胞的生長抑制、促凋亡、抗氧化、抗菌和抗炎作用。其他靶基因，如增殖標記物Ki-67也被用作癌癥的預后標記物[13]。BCL2L1是一種重要的凋亡調節基因，編碼抗凋亡的Bcl-xL和促凋亡的Bcl-xS剪接變體、CEACAM-1也是與結腸癌相關的基因[14]。本研究觀察了癌癥及炎癥相關基因與5-ASA長期治療的相關性。

本研究結果顯示，結腸活檢組織中COX-2、CDC25A、CXCL10、IL8、NF-κB和Ki-67轉錄水平變化與5-ASA治療持續時間相關。這些抗炎和細胞周期調控基因降低可通過5-ASA的抗癌作用和降低疾病活動進行解釋，5-ASA的抗炎作用與抗癌作用可能存在重疊。既往研究[15-17]證實，UC的嚴重程度與炎癥程度呈正相關，與結腸炎相關的發育不良和結直腸癌密切相關。但有研究[18]顯示，一些已知參與癌變過程的基因(PPARγ、CEACAM、β-catenin和P53)的表達減少與患者UC疾病活動性無關。此外，COX-2、IL-8和TNF被認為是炎癥的重要標志物，與炎癥的臨床表現(Mayo AI和組織學)相關，而與炎癥和癌變相關的Ki-67、NF-κB和CXCL10僅與內窺鏡表現相關。這可能提示5-ASA即使在沒有明顯改善潰瘍性結腸炎活動情況下也具有癌癥化學預防作用。考慮到本研究中獲得的活檢樣本是包括上皮細胞、間充質細胞和炎性細胞的細胞群，僅根據基因表達的變化難以詳細區分5-ASA抗炎和抗癌效果，未來研究中評估這些基因在5-ASA治療患者活檢組織中的原位表達或蛋白水平，將為5-ASA分子靶點的作用提供更多的證據。

在結直腸癌細胞系和小鼠UC模型中，5-ASA暴露產生的抗炎和抗腫瘤作用伴隨著PPARγ水平的升高，在某些情況下，COX-2表達同時降低。據報道，與健康志愿者相比，UC患者的PPARγ水平顯著降低，并且局部使用羅格列酮(一種PPARγ激動劑)治療的活動期UC患者的Mayo內窺鏡評分降低程度與5-ASA相似[19]。然而，在本研究中，PPARγ的轉錄水平與疾病活動性或疾病持續時間無關。然而，COX-2的表達與5-ASA暴露時間顯著相關。細胞學研究[20]顯示，每隔24 h反復暴露于2 mM 5-ASA可持續抑制與炎癥、細胞周期檢查點調節和凋亡有關的基因靶點(Ki-67、CXCL10、IL-8、BCL2L1、CASP8和CDC25A)。這些觀察結果表明，長期堅持美沙拉秦方案是獲得最大療效必要條件。

這些結果表明，美沙拉秦長期治療可調控與癌變相關的多個基因，為UC患者長期使用美沙拉秦作為結直腸癌化學預防提供了依據。