聚乳酸/聚乙二醇/羥基磷灰石多孔骨支架的3D打印制備及其生物相容性

范澤文，趙新宇，邱 帥，王 艷，郭 靜，權慧欣，徐蘭娟

(1 大連工業大學 紡織與材料工程學院，遼寧 大連 116034;2 大連醫科大學附屬第一醫院,遼寧 大連 116011;3 鄭州大學附屬鄭州中心醫院,鄭州 450007)

骨組織生物工程支架材料可用于骨的修復和替代，能夠為特定的細胞提供結構支撐，還可以作為模板引導組織再生和控制組織結構。骨組織支架材料的選擇、改性和結構設計已經成為骨組織生物工程材料領域中重要的研究方向[1-3]。3D打印技術近來已被廣泛用于生物醫學領域[4]，其最大的優勢是可利用數字化模型快速成型精準復雜的制品。多孔支架的成型可以借助3D打印技術獲取適合的孔徑，調控細胞在支架表面和內部的生長、增殖和分化。

聚乳酸(PLA)因其具有良好的物理、化學和生物性能，被廣泛應用于組織工程支架領域，但同時存在生物活性低和韌性差等缺點，這極大限制了PLA在骨組織生物工程材料領域的應用[5-6]。Rosenzewig等[7]采用3D打印技術成功制備ABS和PLA兩種生物支架，并對原代關節軟骨細胞和髓核細胞在支架上的生長、生存能力和組織代謝等進行研究。除了直接對PLA進行打印外，對其改性也是研究的重點。Tiziano等[8]采用3D打印成型方法，用聚乙二醇(PEG)和具有生物活性的磷酸鈣(CaP)玻璃對PLA進行改性并成功制備生物支架。結果表明，隨著PEG的加入，PLA/PEG/CaP玻璃復合材料的親水性和彈性模量會增加，而PEG含量過高會導致復合材料三維結構不均勻及力學性能的下降；體外降解研究表明，PEG的加入顯著加速復合材料的降解速度，同時也改善了PLA的加工性能。

本工作通過利用PEG的兩親性、生物相容性[9]以及HA的生物活性和對PLA的增強效果[10]，通過共混改性獲取力學性能改善和生物相容性好的PLA/PEG/HA復合線材，并利用熔融沉積(FDM)3D打印技術獲取多孔支架。并證明了復合材料具有良好的生物相容性，為PLA復合材料在生物工程支架領域的應用提供基礎數據和理論指導。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原料

聚乳酸：4032D，美國NatureWorks公司；聚乙二醇：相對分子量2000，日本青木株式會社；羥基磷灰石：5～20 μm，上海圻明生物科技有限公司。

1.2 樣品制備

將PLA在80 ℃烘箱中干燥12 h后與PEG/HA(按不同比例)熔融混合擠出(轉矩流變儀，Polylab QB)，包括純PLA共6組，并牽引獲得直徑約為1.75 mm的線材。質量組成分別為(1)PLA：質量為200 g；(2)～(6)：PLA與PEG的質量比均為9∶1，且總質量為200 g，HA的添加量分別為0%(質量分數，下同),2%(4 g),4%(8 g),6%(12 g),8%(16 g)。試樣(1)～(6)依次簡稱為PLA,HA0,HA2,HA4,HA6,HA8。

1.3 結構表征與性能測試

1.3.1 3D打印力學試樣及多孔支架表征

根據GB/T 1040標準，利用CAD設計拉伸、沖擊試樣的3D打印模型和多孔支架模型，如圖1(a)，(b)所示(d=14 mm，h=2 mm)。按1.2節的方法制備線材并3D打印試樣。CR-10(400)型3D打印機參數及設置：噴頭內徑0.4 mm，溫度200 ℃，底板溫度40 ℃，打印層厚0.1 mm，打印速率50 mm/s，填充率100%(線性填充)；打印方向如圖1(a)所示(拉伸試樣平行于拉伸方向，沖擊試樣垂直于沖擊方向)。多孔支架的打印條件不變，填充率為0。

圖1 3D打印拉伸、沖擊試樣模型(a)和多孔支架模型(b)

1.3.2 DSC分析

分別稱取一定量的PLA,HA0,HA2,HA4,HA6,HA8用作DSC(QAT-2000)測試，起始溫度40 ℃，以10 ℃/min升溫到200 ℃，保持3 min再以10 ℃/min降溫到40 ℃，消除熱歷史后以10 ℃/min升到200 ℃，記錄第二次升溫曲線。

1.3.3 流動性分析

把擠出線材于190 ℃，10 MPa模壓成直徑25 mm，厚度1 mm的圓片。依靠DHR-2型旋轉流變儀運動產生剪切流動來確定材料的黏性。測試條件：剪切掃描模式，溫度190 ℃，剪切速率1～3500 rad·s-1。

1.3.4 支架形態及細胞黏附SEM觀察

HA2復合材料線材做原料，將圖1(b)的多孔支架模型實體打印出來。在JSM6460LV型掃描電子顯微鏡下進行形態觀察。

將大鼠骨髓間充質干細胞消化后離心，重懸制備成細胞懸液后以1×105個/孔的濃度接種到支架材料表面培養24 h，室溫下4%多聚甲醛固定6 h，經30%,40%,50%,70%,80%,90%,95%,100%濃度無水乙醇脫水，每一濃度脫水15 min，100%濃度脫水兩次，充分干燥后于掃描電鏡下觀察細胞生長情況。

1.3.5 細胞骨架及細胞核的激光掃描共聚焦(LSCM)觀察

將大鼠骨髓間充質干細胞消化后離心，重懸制備成細胞懸液后以1×105個/孔的濃度接種到支架材料表面培養24 h，室溫下4%多聚甲醛固定30 min后分別進行鬼筆環肽和DAPI染色，清洗后于FV1000型激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.6 力學性能測試

拉伸性能測試(Instron5900電子萬能材料試驗機)：將復合材料線材及3D打印(啞鈴形)樣條在室溫下以20 mm/min的拉伸速率進行靜態拉伸測試，記錄材料的拉伸強度、斷裂伸長率和彈性模量。

沖擊性能測試(XJUY-22Z懸臂梁沖擊試驗機)：缺口深度2 mm，記錄沖擊強度。

2 結果與分析

2.1 3D打印線材的力學性能分析

3D打印線材力學性能的好壞直接影響著打印制品的質量。圖2為PLA/PEG/HA復合線材的力學性能測試曲線。添加PEG后PLA的斷裂伸長率由約10%提高到約18%，因為PEG可以充當PLA的增塑劑，有助于PLA分子鏈的伸展，并且PEG分子能進入到PLA大分子中增加PLA分子的空間體積，削弱PLA分子的相互作用力從而增加PLA韌性[11]。添加HA后斷裂伸長率迅速下降，HA屬無機粒子，具有小尺寸效應，它的添加會阻礙HA0分子鏈構象的轉變，降低HA0的韌性，但有增強PLA的作用；所以復合材料在屈服之前，HA2的彈性模量要比PLA高，HA4,HA6也依然如此，HA6的彈性模量最高，比PLA高出約1 GPa。但HA8無論是拉伸強度還是彈性模量表現均較差，這可能是由于HA含量過高產生了團聚，另一個原因可能是HA可以充當PLA異相成核劑誘導其結晶[12]，并因HA含量過高可能使晶粒結晶不完善產生缺陷導致力學性能下降[13]。這與后邊DSC的分析結果一致。PLA/PEG/HA線材的具體拉伸性能參數如表1所示。

圖2 PLA/PEG/HA線材的拉伸性能曲線

表1 PLA/PEG/HA線材的拉伸性能

2.2 3D打印線材的熱性能分析

圖3 PLA/PEG/HA復合材料的DCS曲線

表2 PLA/PEG/HA復合材料的結晶參數

2.3 3D打印線材的流動性分析

線材的流動性和黏度對成型制品的好壞有直接的影響，圖4為PLA/PEG/HA復合材料的流動性曲線。在低剪切頻率下表觀黏度(η*)基本保持不變，表現為牛頓流體特性，在高剪切頻率下熔體表現為剪切變稀，為典型的假塑性非牛頓流體行為。在剪切速率較小時，PLA和HA0的η*較大，這可能是因為PLA的分子鏈和PEG的分子鏈可以形成一種擬網狀的纏結結構使阻力增加導致的[17]。同時發現HA0的η*比PLA大，這可能是因為PEG分子進入到PLA大分子中增加了整個鏈的纏結使阻力增加所導致的。摻入HA后HA2的η*下降很多，這可能是因為在剪切過程中HA粒子可以充當潤滑劑，使運動單元躍遷較為容易。對于HA4和HA6組分來說，初始η*降到最低，在410 rad/s下HA6的η*只有7.2×10-4Pa·s，而在適當的剪切速率下(8～20 rad·s-1)，HA4,HA6的熔體黏度要比PLA降低4個數量級。這除了在高剪切的作用下，HA充當潤滑劑的作用也尤為明顯。HA8因為HA粒子間也存在一定的摩擦力，潤滑劑的作用明顯下降。從而阻礙了運動單元的躍遷，所以HA8的η*不降反升。而降低PLA的η*也有助于其加工成型和3D打印成型。

圖4 PLA/PEG/HA復合材料的表觀黏度(η*)與剪切速率(ω)曲線

2.4 3D打印試樣的力學性能分析

2.4.1 3D打印拉伸試樣力學性能分析

選取4組力學性能較好的線材來做3D打印的原料，4組打印線材分別是PLA,HA0,HA4和HA6。擠出過程中發現HA8線材的流動性不好，不適合做打印線材。圖5為力學試樣的打印實體，觀察發現其打印質量與成型精度都很高。說明挑選的線材完全可以3D打印，這為后期打印多孔支架提供了可行性保障。

圖5 3D打印拉伸和沖擊試樣的光學圖片

圖6為3D打印樣條拉伸測試曲線。與線材結果類似，PEG的添加增加PLA分子的空間體積，有助于PLA分子鏈運動，從而提高其韌性。HA雖有增強高分子材料的作用，但3D打印成型由于其增材的特性，會削弱試樣的整體性，導致HA增強效果下降，不過依然保留了一定的力學性能可以滿足多孔支架的基本要求。

圖6 3D打印試樣的拉伸性能曲線

2.4.2 3D打印沖擊試樣的力學性能分析

表3為3D打印成型沖擊試樣的測試結果。如表所示PLA的沖擊強度為1.744 kJ/m2，而PEG的添加增加了PLA分子的空間體積，有助于PLA分子鏈的運動從而提高其韌性，使HA0沖擊強度提高。然而，HA雖有增強PLA的作用，但它的添加使材料剛性增加，降低沖擊強度。而且3D打印成型會使制品中存在打印結點，削弱材料的整體性；并且打印方向與沖擊方向垂直，這些可能都會在一定程度上削弱PEG的增韌效果，降低HA0沖擊強度。DSC和線材拉伸結果表明，PEG增韌明顯，而且與PLA相容性較好，這使得即使添加HA后，沖擊強度還是會得到較大的保留，依然高于純PLA。

表3 3D打印PLA/PEG/HA復合材料的沖擊性能

2.5 多孔支架的結構及生物相容性分析

組織工程支架的孔結構對細胞的黏附、遷移和增殖有重要的影響，其中孔徑的尺寸在很大程度上決定著細胞能不能在支架材料中遷移和生長[18]。圖7為3D打印PLA/PEG/HA復合材料多孔支架的SEM照片。圖7(a)為多孔支架的表面，其孔徑約為800 μm；圖7(b)為它的局部表面放大圖。圖7(c)為多孔支架斷面，其孔徑約為400 μm；圖7(d)為其局部斷面放大圖。從圖7(a)～(d)可以看出3D打印多孔支架實體的孔徑十分規整，打印效果好且打印精度高，這為細胞在支架材料中遷移、生長以及動物體內和體外實驗的可行性提供基礎保證。此外，從圖7(e)～(f)能看出，支架表面存在一定的粗糙度。這對細胞的黏附、增殖、遷移和分化等也起到促進作用。

圖7 PLA/PEG/HA復合材料多孔支架的SEM照片

細胞在材料表面的黏附、鋪展對評價組織工程材料的性能具有相當重要的意義。圖8為大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)在多孔支架上的黏附和標記的結果。圖8(a)為大鼠BMSC在多孔支架上的黏附狀況，細胞在材料表面12 h即形成了穩定的黏附，并從圖8(b)可看出部分細胞開始在材料表面鋪展，表明支架具有良好的生物相容性。并且通過激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope, LSCM)對大鼠BMSC在支架表面上的黏附進行觀察。圖8(c)為大鼠BMSC的24 h細胞骨架的熒光標記結果，圖8(d)為大鼠BMSC的24 h細胞核熒光標記結果，結果顯示大鼠BMSC的細胞核和細胞骨架形態良好，表明多孔支架具有良好的生物相容性且無毒性。這為PLA/PEG/HA復合材料成為骨組織工程材料提供了重要的保障，也拓寬了3D技術在定制生物支架上的應用。

圖8 大鼠間充質干細胞在多孔支架上的生物相容性測試

3 結論

(1)利用熔融共混技術制備不同組分的PLA/PEG/HA復合線材，并通過分析復合材料的各種性能，篩選出適合3D打印成型的線材，并成功制備出力學性能優異的試樣及生物相容性好、孔徑規整的多孔支架。

(2)PEG的添加把PLA線材斷裂伸長率由約10%提高到約18%，Tcc降低約18 ℃；加入HA后，PLA的彈性模量最多提高約1 GPa，Tm最多降低約7 ℃；而在適當的剪切速率下(8～20 rad·s-1)，HA4,HA6的熔體黏度要比PLA降低4個數量級。

(3)多孔支架的表面孔尺寸約為800 μm，斷面孔尺寸約為400 μm；這個孔徑的支架表面適合細胞的黏附、增長與分化；多孔支架與細胞12 h即形成了穩定的黏附與鋪展；24 h后，細胞骨架與細胞核的形態良好，細胞生長、生存狀況極佳。多孔支架的成功制備，為其在生物醫學方面的應用提供了一些數據支持，為進一步發掘改性3D打印線材在生物醫學方面的應用提供了可能。