pH敏感水凝膠微球的制備及二甲酸鉀緩釋和抗菌性能分析

郭小煒，李玉妍，王秀麗，楊忠鑫，陳南春，解慶林

(1 桂林理工大學 材料科學與工程學院，廣西 桂林 541004；2 桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林 541006；3 桂林理工大學 廣西巖溶地區水污染控制與用水安全保障協同創新中心，廣西 桂林 541006)

水凝膠是聚合物鏈通過物理、離子或共價相互作用交聯而合成的大分子聚合物凝膠，可通過氫鍵吸收大量的水[1]。水凝膠可以設計成具有優選特性的藥物遞送系統，理想的水凝膠可以根據溫度和pH等物理變化選擇性釋放藥物[2-3]。

復合水凝膠是巨大的三維網狀聚合物，彼此通過化學或物理交聯而結合，它們的水合和多孔結構可以模擬組織固有的特性、結構和微環境。可通過聚合物結構中的功能基團獲得改進性能的復合水凝膠[4]。沸石分子篩具有獨特的孔結構、較大的比表面積、可調節的酸堿位點等特征。同時沸石分子篩有較好的生物相容性和無毒性，使其在藥物遞送中得到廣泛的引用[5]，在聚合物中加入無機材料沸石分子篩，可以大大提高材料的力學性能[6]。CMC分子鏈中有多個羧基，與金屬離子具有出色配位能力[7]。由于CMC無毒性、良好的配位能力、可生物降解性和低成本優勢，已經開發出許多基于CMC的水凝膠。殼聚糖[8]是自然界中唯一的一個帶正電荷的天然高分子，其分子鏈上存在著大量的氨基基團。CMC和CS兩者可以形成有效的結合，會使兩種高分子在水溶液中交聯，形成聚電解質復合物，殼聚糖(CS)[9]和羧甲基纖維素(CMC)[10]已被用作pH敏感的藥物遞送系統。

二甲酸鉀(KDF)是一種略顯負電性的新型的綠色抗菌劑，添加到動物飼料中具有降低胃腸道pH值、調節腸道微生物生態平衡、提高飼料營養物質的消化和吸收等功能[11]。但直接飼喂KDF主要在小腸前端發揮作用，利用率不高，不能充分發揮二甲酸鉀調節腸道的作用。為解決這一問題，本工作制備了全新的與Fe3+交聯的殼聚糖-羧甲基纖維素-P型分子篩復合水凝膠微球，具有高pH敏感性，可使二甲酸鉀穩定到達腸道釋放并發揮抗菌作用。

因為pH因素是控制藥物釋放的關鍵，本工作為控制KDF的釋放，提出了一種使用CS，CMC作為pH敏感聚合物的改進方法。通過凝聚法制備了CS@CMC@Zeolite P@KDF復合水凝膠抗菌微球，用于在生理pH條件下選擇性釋放藥物，為KDF的有效利用提供了一種可行的模型。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(脫乙酰度：>90.0%)，羧甲基纖維素(黏度：800～1200 mPa·s)，國藥集團化學試劑有限公司，化學純CP；氯化鐵(FeCl3)，冰醋酸(CH3COOH)，西隴科學股份有限公司,分析純AR；二甲酸鉀晶體(≥98%)，武漢遠成科技有限公司；PBS磷酸鹽粉劑(pH 7.2～7.4)，Phygene Scientific公司；Zeolite P實驗室[12]和去離子水，實驗室自制。

Zeolite P表面和水凝膠微球內表面(剖開)微觀形貌采用JSM-6380LV型掃描電子顯微鏡進行觀察。Zeolite P物相分析采用X′Pert PRO型X射線粉末衍射儀對樣品進行測試。采用ZS90 Zeta電位儀對不同pH下Zeolite P電位進行測試。材料官能團變化采用Thermo Nexus 470FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀進行測試分析。材料的穩定性采用Q500 TGA熱重分析儀進行測試表征。

1.2 水凝膠微球的制備

1.2.1 復合水凝膠微球的制備

Zeolite P(0%，0.5%，1.5%,質量分數，下同)于100 mL去離子水中超聲分散10 min，緩慢加入3.0 g CMC，邊加邊攪拌，待CMC溶解后靜置12 h，得到溶液A。稱取2.0 g CS加入到100 mL冰醋酸(2%)，溶解后靜止12 h脫泡，得到溶液B。用5 mL針筒緩慢把溶液A滴加到4.0% FeCl3溶液中，交聯30 min，過濾洗滌，把CMC@Zeolite P凝膠微球放入溶液B，攪拌30 min，過濾洗滌，冷凍干燥即可得CS@CMC@Zeolite P復合水凝膠微球見圖1。

圖1 復合水凝膠微球

1.2.2 抗菌微球的制備

Zeolite P(0%，0.5%，1.5%)于100 mL去離子水中超聲分散10 min，加入0.4 g KDF攪拌3 h，加入3.0 g CMC，邊加邊攪拌，待CMC溶解后靜置12 h，得到溶液C。用5 mL針筒緩慢把溶液C滴加到4.0% FeCl3溶液中，交聯30 min，過濾洗滌，把CMC@Zeolite P@KDF凝膠微球放入溶液B，攪拌30 min，過濾洗滌，冷凍干燥即可得CS@CMC@Zeolite P@KDF復合抗菌微球。

1.3 測試分析

1.3.1 溶脹性分析

通過浸泡法測定水凝膠微球吸水性，研究其溶脹行為。配置3種不同pH值分別為1.2(模擬胃液)、6.8(模擬小腸液)、7.4(模擬大腸液)磷酸鹽緩沖溶液。準確稱量0.02 g干燥后均勻復合水凝膠微球顆粒，浸泡在相應pH磷酸鹽緩沖溶液中。緩慢攪拌，間隔一定的時間，取出微球，用濾紙吸附表面黏附的液體，立即稱重。通過公式(1)計算微球的溶脹率(S)：

(1)

式中：Mt為某一時間t水凝膠微球吸水膨脹后的質量；M0為水凝膠微球的初始質量。

1.3.2 KDF釋放行為

稱取定量KCl，以去離子水為溶劑，配制濃度為0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 mg/L的鉀離子標準溶液，使用原子吸收分光光度計測定各濃度的吸光度，得到鉀離子的標準曲線。線性回歸方程式(2)為：

y=0.03116x+0.01507

(2)

式中：y代表吸光度，x代表鉀離子濃度，相關系數R2=0.99676。

稱取1.74 g NaH2PO4，2.7 g Na2HPO4和1.7 g NaCl，溶解在400 mL去離子水溶液，使用NaOH溶液調節pH為7.4。將0.4 g抗菌微球碾碎置于50 mL溫度為37 ℃的磷酸鹽緩沖溶液中(pH=7.4，不含鉀離子)，緩慢攪拌，使KDF充分溶出，離心得到上清液。利用原子吸收分光光度計測定鉀離子的吸收值，根據標準曲線方程式(2)，計算抗菌微球中KDF的含量。并按式(3)計算包封率(EE)，按式(4)計算載藥率(LC)：

(3)

(4)

式中：m1為抗菌微球中KDF含量,g；m2為KDF投加量,g；m3為抗菌微球的質量,g。

分別稱取0.4 g形貌完整的復合抗菌微球，置于100 mL磷酸鹽緩沖溶液，于常溫緩慢攪拌，每次取1 mL溶液適當稀釋，定時段通過原子吸收分光光度計測試，每次取出溶液之后，立刻添加相同體積、相同pH值的磷酸鹽緩沖溶液，根據鉀離子標準曲線計算KDF的含量，考察抗菌微球中KDF的釋放情況。

1.3.3 體外抗菌測試

采用微孔板法進行體外抗菌測試,用抗菌微球和液體培養液(胰蛋白胨1 g，牛肉膏0.5 g，氯化鈉0.5 g，100 mL去離子水溶解，調節pH為7.2，高溫高壓滅菌20 min)配制濃度為48 mg/mL抗菌液，將48 mg/mL母液依次稀釋為24，12 mg/mL。向樣品測定孔中加入上述濃度的抗菌液和純液體培養液各200 μL，每個濃度重復3組實驗，依次加入大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液10 μL，于37 ℃條件下，在恒溫振蕩培養箱中振蕩培養，每隔4 h用酶標儀在波長為630 nm處測定其吸光度(即OD 630 nm值)，每組實驗結果取平均值[13]。

2 結果與分析

2.1 Zeolite P特征分析

圖2為制備的Zeolite P XRD圖譜，與Zeolite P的標準卡片JCPDS card No.01-071-0962表現出較高的匹配，衍射峰位置基本一致[14]。圖3為制備的Zeolite P的SEM圖，Zeolite P平均粒徑大小為0.5 μm。

圖2 P型分子篩XRD圖譜

圖3 P型分子篩的掃描圖

圖4為隨pH變化Zeolite P的Zeta電位圖，曲線與0電位的交點為5.37，當溶液pH值大于5.37時，Zeolite P表面帶負電荷，具有吸附陽離子的能力；當溶液pH值小于5.37時，Zeolite P表面帶正電荷，具有吸附溶液中陰離子的能力。當pH值在3.0～5.37之間，Zeolite P表面呈正電位，同時由于其較高的比表面積，為吸附KDF提供了條件。結果表明，在pH值為3.0～5.37條件下，Zeolite P和KDF有較好的結合能力。孟祥儉等[15]利用XPS表征沸石分子篩與KDF的結合關系，結果表明Al2p周圍化學環境發生了變化，周圍電子云密度降低，應該是KDF與分子篩形成了氫鍵；同時分子篩中的鈉周圍的環境也發生變化，可能是KDF中的鉀將分子篩中的鈉取代。表明Zeolite P對KDF有較好的吸附作用。

圖4 P型分子篩的Zeta電位

2.2 復合水凝膠微球的形貌和結構分析

圖5為復合水凝膠微球的內剖圖，內部為致密的結構，EDS結果顯示含有Zeolite P的特征元素Al和Si，表明Zeolite P鑲嵌在CMC三維網狀結構中，對復合水凝膠微球骨架具有支撐作用。

圖5 CS@CMC@Zeolite P內剖圖(a)及其內表面EDS譜圖(b)

對原材料Zeolite P，CMC，CS，CS@CMC@Zeolite P進行紅外分析，分析結果如圖6所示。與CMC和CS中的3458，3431 cm-1處峰值相比，CS@CMC@Zeolite P羥基峰特征峰變得寬且大，紅移到3420 cm-1，說明CS，CMC和Zeolite P之間存在氫鍵用力；同時CS@CMC@Zeolite P中的特征峰衍射峰偏移到1596 cm-1，這是由于CS中—NH2基團(1644 cm-1)與CMC中的—COOH基團(1623，1418 cm-1)相互作用，CS與CMC通過離子鍵與氫鍵形成聚電解質復合物。CS@CMC@Zeolite P特征峰中存在600～1000 cm-1Zeolite P骨架震動特征峰，但是強度有所減小，說明Zeolite P被包覆在復合水凝膠微球中。

圖6 紅外對比譜圖

2.3 復合水凝膠微球的熱穩定性分析

圖7為CMC，CS，CS@CMC，CS@CMC@Zeolite P各組的熱重分析曲線。可以發現CS@CMC與CS@CMC@Zeolite P在前期主要為結合水的蒸發，隨后在200 ℃開始緩慢分解。分解溫度小于CS和CMC的裂解溫度，這是由于兩種高分子材料混合后產生的離子鍵作用力會削弱兩種高分子本身分子內部以及同類分子之間的相互作用力[16-17]。但是離子鍵的存在會提升整體的熱穩定性，對比同時失重50%質量的溫度可知：CS@CMC在溫度455 ℃才損失一半質量，而CS與CMC分別在325 ℃和365 ℃已經損失一半質量，說明CS@CMC比天然高分子具有更高的熱穩定性，這是由于聚合物結構的改變以及CMC與Fe3+的相互作用。然而在加入Zeolite P后，觀察到其在損失50%質量時的溫度低于CS@CMC體系，這可能是由于Zeolite P的塑化作用，增加了CMC基質中的孔隙度，降低了CMC基質在特定溫度范圍的穩定性。TGA的分析結果可從側面反映出兩種高分子之間存在著離子鍵的結合，CS@CMC@Zeolite P體系在常溫是熱穩定的。

圖7 熱重分析譜圖

2.4 復合水凝膠溶脹行為分析

圖8為Zeolite P添加量在不同pH磷酸鹽緩沖溶液對CS@CMC@Zeolite P溶脹行為的影響。復合水凝膠微球的溶脹行為可表明液體滲透到CS@CMC@Zeolite P微球中的速度和容易程度，以及對環境pH的敏感性。圖8顯示了不同pH下復合水凝膠微球的溶脹率之間的顯著差異，表明復合水凝膠微球對pH高度敏感。在酸性條件下，CMC鏈形成緊密的螺旋狀，CMC結構壓縮，溶脹得到抑制。因此，在pH從1.2增加到7.4的過程中，CS@CMC鏈上的羧基轉化為帶負電荷的羧酸根離子，導致更高的靜電斥力和水被吸收。同時CS包裹在CMC外部，形成的聚電解質復合物，避免水凝膠微球的瓦解。加入的Zeolite P鑲嵌纏繞在CMC三維網格結構中，限制了聚合物鏈的擴展，導致其溶脹率比CS@CMC偏小。CS@CMC@Zeolite P在酸性條件下具有較小的溶脹率，可以減緩KDF溶出釋放。所制備的CS@CMC@Zeolite P水凝膠微球能夠應用于不同pH條件下的可持續給藥系統。

圖8 不同pH CS@CMC@Zeolite P微球溶脹行為

2.5 KDF緩釋行為分析

圖9為Zeolite P添加量對CS@CMC@Zeolite P釋放KDF的行為影響，在pH為7.4的環境下，CS@CMC@KDF突釋現象明顯，后續對KDF的釋放也較快；添加Zeolite P之后CS@CMC@Zeolite P可有效減緩突釋現象的發生，且對KDF具有有效的控釋行為。由于KDF是水溶性的，導致包封率和載藥率相對較低，添加1.5%Zeolite P抗菌微球具有最大包封率37.17%和最大載藥率12.39%。

圖9 Zeolite P添加量在pH=7.4環境下CS@CMC@Zeolite P@KDF微球釋放KDF行為分析

KDF的釋放模型見圖10。在酸性環境中，CS表面的氨基基團緩慢電離，質子化的氨基在微球表面形成了水合層，阻礙水分子滲入微球，同時CMC鏈段在酸性環境中卷曲收縮，與內部的Zeolite P共同延緩了水分子進入微球內核，使KDF的溶出變得困難。在pH=7.4環境下，CMC表面的羧基去質子化，分子鏈段舒展，導致更多的水分子穿透聚合物結構，進入到水凝膠微球的內部，使KDF更加容易釋放。KDF在中性或偏堿性環境中電離增強，溶解度增加。Zeolite P的含量增加，使KDF從微球內核遷移到表面更加的困難。釋放結果表明，制備的CS/CMC/Zeolite P復合水凝膠微球載藥體系，可用于胃腸道pH敏感環境中KDF的控釋。

圖10 CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球KDF的釋放示意圖

對添加1.5% Zeolite P抗菌微球進行釋放動力學研究(表1)，零級釋放模型用來解釋一些常見的糖衣藥物和膠囊藥物的釋放過程。一級釋放模型一般適用包含水溶性藥物的多孔基質。Higuchi方程常擬合藥物濃度擴散過程。

表1 釋放動力學模型

對添加1.5% Zeolite P抗菌微球進行釋放動力學方程擬合(圖11)。在pH=7.4環境中CS@CMC@Zeolite P相關系數R2在零級、一級動力學方程以及Higuchi擬合方程中分別為0.48945，0.79629和0.7209。KDF的控釋符合一級動力學方程和Higuchi擬合方程。所制備的復合抗菌微球對KDF具有一定的控釋作用，KDF的釋放為溶出擴散機制，形成了較為穩定的多孔水溶性微球。

圖11 CS@CMC@Zeolite P@KDF微球在腸道模擬中動力學方程擬合結果

2.6 抗菌微球抑菌行為分析

KDF被動物食用后，可以降低胃腸道的pH值，控制細菌的生長。同時KDF在通過細菌細胞壁后解離并對細菌蛋白質合成產生破壞作用，未分離的KDF可以通過微生物的半透膜擴散到它們的細胞質中；一旦進入細胞，環境pH值在7附近，KDF就會解離并抑制細胞酶和營養物轉運系統，從而殺死細菌并抑制細菌的繁殖。細菌需要營養來維持自身的新陳代謝，并與宿主競爭胃和腸道的營養。胃和腸道中細菌的數量越少，動物可以吸收的營養就越多[18-19]。使用KDF來減少胃腸道中的致病性和非致病性細菌對于動物的膳食能量利用是可行有效的。

圖12為不同CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球含量對大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)生長的影響。CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有顯著的抑菌效果，隨著抗菌微球濃度越高，其抑菌效果更明顯。抗菌微球可有效抑制細菌的滯后期，隨著濃度的增加，細菌的滯后時間越長，表明抗菌微球抑制了細菌的生長，影響了細菌生長所需的酶、能源和中間代謝產物。同時，細菌的對數生長期也明顯縮短。與王秀麗等[20]制備的Zeolite P抗菌劑相比，相同抗菌液濃度，具有更高的抑菌性，所制備的CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球能負載有效的KDF，具有更優異的抗菌性。在24 mg/mL和48 mg/mL濃度下，細菌生長受到抑制，較多菌體死亡，幾乎不再繁殖，但是在低濃度時(12 mg/mL)具有時效性。可預見的高濃度下的抗菌液具有較低的pH值，可以改變細菌生長的環境，抑制細菌的繁殖。當抗菌液分解完之后，細菌開始快速繁殖。

圖12 不同抗菌微球含量對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的生長影響

3 結論

(1)通過凝聚法，經Zeolite P吸附KDF分散在CMC基質中，FeCl3作為交聯，與CS組裝制備出了KDF緩釋抗菌微球。CS與CMC通過離子鍵形成聚電解質復合物，形成的水凝膠微球比天然高分子材料CS和CMC具有更高的熱穩定性，Zeolite P鑲嵌纏繞在CMC基質中。

(2)CS@CMC@Zeolite P吸水溶脹差異性表明復合水凝膠微球具有高pH敏感性。CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球對KDF具有良好的控釋效果，添加Zeolite P可有效減小突釋現象的發生，且對KDF具有更為優異的控釋效果。通過釋放動力學線性擬合，釋放過程遵循一級動力學模型和Higuchi模型，所制備的抗菌微球對KDF具有一定的緩釋作用。

(3)制備的抗菌微球CS@CMC@Zeolite P@KDF對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抑制生長的效果，在抗菌液濃度為24,48 mg/mL時，細菌生長受到抑制，幾乎不再繁殖，低濃度下具有時效性，但前期仍具有抗菌性。所制備的CS@CMC@Zeolite P@KDF體系為KDF的推廣和使用提供了參考。