胸腺五肽的固相合成

唐文力，李宜航

(常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000)

隨著醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，多肽類藥物的發(fā)展正越來越引起醫(yī)藥界的關(guān)注。胸腺五肽在醫(yī)用上良好的產(chǎn)業(yè)前景使得人們將注意力紛紛集中在大規(guī)模生產(chǎn)上，由于采用生物提取會(huì)受材料來源限制，而基因表達(dá)技術(shù)運(yùn)用在小分子肽上存在困難等問題，其分子式簡單的特點(diǎn)使化學(xué)法合成胸腺五肽獨(dú)具優(yōu)勢，固相化學(xué)合成成為獲得胸腺五肽的重要途徑。

近年來，固相法得到了很大發(fā)展， Boc法[1](Boc:叔丁氧羰基)和 Fmoc固相法[2](Fmoc:9-芴甲氧羰基)。以這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動(dòng)合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善。本實(shí)驗(yàn)采用Fmoc固相法，F(xiàn)moc法避免了接肽時(shí)反復(fù)使用強(qiáng)酸的弱點(diǎn)，每次去保護(hù)時(shí)釋放出可檢測的化合物以及沒有腐蝕性試劑參與反應(yīng)，其溫和的反應(yīng)條件使得反應(yīng)過程溫和可控。此外，本研究采用的Rink樹脂合成片段還可以方便自動(dòng)化生產(chǎn)[3-7]；Rink樹脂可以回收重復(fù)利用；適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，沒有劇烈的化學(xué)反應(yīng)；降低了生產(chǎn)成本。

1 儀器與試劑

Waters 2695型高效液相色譜、Milli--Q超純水系統(tǒng)，德國默克密理博公司；紫外分光光度計(jì)、GL-150干式恒溫器(block heater)、XW-80A旋渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平TP-214，丹佛儀器有限公司(d=0.1 mg)；GL-150干式恒溫器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

Wang Resin(AR，南開和成科技有限公司，交聯(lián)度 1%，取代率 0.47 mmol/g)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、卡特縮合劑(BOP)、二甲氨基吡啶(DMAP)均采購自蘇州昊帆生物股份有限公司、甲醇、醋酸酐、吡啶、二氯甲烷均采購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑配制

2.1.1 20%pip/DMF溶液(脫保護(hù)液)的配制

20%哌啶DMF溶液：取100 mL哌啶溶于400 mL DMF中。

2.1.2 磷酸緩沖液的配制

將2.738 g NaH2PH4·2H2O(M=156.01)和9.834 g Na2HPH4·12H2O(M=358.14)溶于900 mL純水中，溶解后，再加入100 mL甲醇，混勻。制成磷酸緩沖液。

2.1.3 裂解液的配制

TFA(三氟乙酸):TIS(三異丙基硅烷):H2O (純水)=95:2.5:2.5 (體積比)，制成裂解液。

2.1.4 茚三酮反應(yīng)所需溶液的配制

(1)溶液a的配制

溶液1：取4 g苯酚溶于1 mL無水乙醇(80%苯酚/無水乙醇溶液[w/v])，加熱至溶解。

溶液2：取0.2 mL KCN(0.001 mol)溶于9.8 mL吡啶中。

溶液a：混合溶液1，溶液2。

(2)溶液b的配制

稱500 mg茚三酮溶于10 mL無水乙醇中(5%茚三酮/無水乙醇溶液，[w/v])，密閉避光保存。

檢驗(yàn)時(shí)加2滴溶液a，1滴溶液b。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以Fmoc-Ala-OH為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),準(zhǔn)確稱量Fmoc-Ala-OH(帶Fmoc的丙氨酸)39.5 mg，用1 mL 20%pip/DMF處理20 min，取其中0.1 mL 用DMF稀釋到10 mL配置成濃度依次為21 μmol/L、42 μmol/L、68 μmol/L、85 μmol/L、106 μmol/L、177 μmol/L的混合溶液，放置待用，見表1。

表1 不同濃度的Fmoc-Ala-OH溶液及吸光度

制成標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線

2.3 胸腺五肽合成

2.3.1 Fmoc-Tyr(tbu)-Val-Asp(tBu)-Lys(BOC)-Arg-樹脂的合成

稱取樹脂0.5 g 于10 mL 反應(yīng)器中，依次稱量Fmoc-Tyr(tbu)-OH 0.25 mmol，230 mg，DCC 0.25 mmol，103 mg，DMAP 0.025 mmol，3 mg。溶于2.5 mL DMF。倒入反應(yīng)器中，溶脹30 min后，加2 mL DMF 搖晃3 h，接著樹脂用DMF洗四遍，甲醇洗四遍，抽極其干。取2 mg樹脂于 1.5 mL離心管中，加1 mL 20%pip/DMF溶液處理20 min，稀釋10倍，測吸光度將5 mL此稀釋液加入50 μL原液(取自1 mL 20%pip/DMF溶液)，測吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算取代率。

取1.25 mmol 醋酐(118 μL)，1.25 mmol 吡啶(100 μL)，7 mL DMF一并倒入反應(yīng)器，反應(yīng)30 min。抽去反應(yīng)液，并用DMF洗滌2次、IPA洗滌3次、DMF洗滌4次。洗滌完成后，取少許樹脂，滴入2.1.4配制的茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗(yàn)溶液呈藍(lán)黑色。

稱Fmoc-Val-OH 0.5 mmol，170 mg。BOP 0.5 mmol，221 mg，3 mL DMF中斡旋溶解，加DIEA0.5 mmol，88 μL。斡旋混勻。于室溫下放置10 min后倒入反應(yīng)器，反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后，用DMF洗滌4遍，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入2.1.4配制的茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗(yàn)溶液呈無色，既反應(yīng)完全。

得到Fmoc-Tyr(tBu)-Val-樹脂后，量取約7 mL脫帽試劑20%pip/DMF溶液，倒入反應(yīng)器中，反應(yīng)20 min，抽去反應(yīng)液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入2.1.4配制的茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗(yàn)溶液呈藍(lán)黑色，既獲得Tyr(tBu)-Val -樹脂。在獲得Tyr(tBu)-Val-樹脂后，按照上述縮合反應(yīng)方法，依次Tyr(tBu)-Val-樹脂上連接氨基酸保護(hù)單體：Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Arg-OH后得到Fmoc-Tyr(tbu)-Val-Asp(tBu)-Lys(BOC)-Arg-樹脂。

2.3.2 胸腺五肽粗品制備

取2.3.1步驟制備的Fmoc-Tyr(tBu)-Val-Asp(tBu)-Lys(BOC)-Arg-樹脂置于干凈的10 mL玻璃反應(yīng)器中，用配制的高酸裂解液裂解樹脂。每次加入約2 mL裂解液，每次裂解時(shí)間為20 min，共裂解三次。將每次裂解后的濾液收集在同一100 mL的離心管中。

在濾液加入約10 mL 60%的乙醚溶液，震蕩混勻。該溶液在4 ℃下，9000 r/min高速離心5 min。離心后倒出上清液(棄)，再加入約10 mL 60%的乙醚溶液，洗滌析出固體，再重復(fù)離心。共離心三次。最后一次倒出上清液后，將離心管置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干。收集風(fēng)干后的五肽樣品，置于1.5 mL離心管中備用。

3 結(jié)果表征

3.1 樹脂取代率的測定

根據(jù)丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液C-Abs曲線，將A301 nm(y)=0.375帶入y=0.0075x+0.0237，可以計(jì)算氨基的濃度(x)為8.97 μmol/L。

取干燥樹脂2 mg測吸光度，考慮到稀釋了100倍，則

取代率=8.97 μmol/L× 100/1000/2 mg=0.449 mmol/L

3.2 樹脂回收率的計(jì)算

脫保護(hù)后的樹脂，稱重，質(zhì)量為m1=8 mg，離心，置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干后，稱重，質(zhì)量為m2=2.3 mg，則：

理論質(zhì)量m3=8 mg×0.47 mmol/g×680=2.556 mg

樹脂回收率=2.3 mg/2.556 mg=89.98%

3.3 高效液相色譜級(jí)質(zhì)譜分析

對(duì)胸腺五肽粗品及標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，色譜柱為Krosmail100-5 C18柱(250 mm×9.4 mm，5 μm)；流動(dòng)相A相(0.1M NaH2PO4/H2O)，洗脫液B(MeCN-H2O=1:1)；梯度洗脫：0～30 min；70%B～40%A，流速為1.0 mL/min，檢測波長為215 nm，其純度為98.54%，見圖2～圖4。

圖2 胸腺五肽標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖3 胸腺五肽標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖4 胸腺五肽粗品質(zhì)譜圖

4 結(jié) 論

(1)根據(jù)根據(jù)高效液相色譜圖和氫譜分析圖可知，合成的化合物為胸腺五肽。再根據(jù)樹脂取代率和回收率的計(jì)算可知，哌啶脫Fmoc法固相合成胸腺五肽產(chǎn)率為88.67%，純度為98.54%。

(2)哌啶脫Fmoc法固相合成胸腺五肽的取代率較高，且回收率也較高的結(jié)果，可使得哌啶Fmoc法固相合成胸腺五肽可在設(shè)計(jì)工藝曲線和自動(dòng)化后，應(yīng)用于工業(yè)批量生產(chǎn)。