金屬釕化合物的制備、表征及抗腫瘤活性評價*

邵長興，余群英

(九江學院藥學與生命科學學院，江西 九江 332005)

有機金屬釕抗癌治療劑因具有良好的生物學特性被認為是鉑類抗癌治療劑的可替代品，一些金屬釕抗癌劑甚至對順鉑產生耐藥性的腫瘤細胞系也同樣有效[1]。近年來，“鋼琴凳式”類八面體有機金屬釕(II)配合物的研究受到了廣泛的關注，其中一個η6-π鍵合的芳烴配體形成“鋼琴座”，其余三個配位基團形成“鋼琴腿”(圖1)。芳烴部分對配合物的活性有著重要的影響，它可以增加配合物的疏水性，促進親脂類物質的吸收[2]。另外，有機金屬釕的抗癌活性受配體配位方式的影響也很大。含P-或N-單齒配體、O,O-雙齒配體、N,O-雙齒配體的有機金屬釕試劑對CH1 (PA-1) 以及A2780細胞無活性，而含S,O-、S,N-、C,N-和N,N-雙齒配體的釕試劑抗增殖活性很高[2]。N,N-螯合配體可以是脂肪族二胺、芳香族二胺、聯吡啶衍生物等含氮有機化合物，為芳烴釕配合物中常見的配體結構。Sadler等報道了具有典型代表性的以二胺為核心的芳烴Ru(II)試劑，他們將惰性雙齒配體1,2-乙二胺(en)和氯作為離去基團配位到芳烴金屬釕核上，合成出[(η6-芳烴)RuCl(en)]PF6(RM175) (圖1)，該釕試劑對人卵巢癌細胞株A2780具有很強的抗增殖活性[2-3]，能與DNA共價結合從而提高了配合物對不同腫瘤細胞的抗增殖活性[4]。Palaniandavar等報道了含蒽基甲基二氮雜環庚烷配體的Ru(II)-芳烴配合物，同DNA和蛋白質顯示出較高的結合力，比含簡單的二氮雜環庚烷配體的Ru(II)-芳烴配合物具有更高的細胞毒活性[5-6]。Zheng等[7]開發了含4-苯胺喹唑啉(4-AQ)的釕(II)配合物(4～9)(圖1)，該配合物對EGFR的抑制活性強于4-AQ。

圖1 “鋼琴凳式”類八面體有機金屬釕(II)配合物，RM-175以及含4-苯胺喹唑啉(4-AQ)配體的釕(II)配合物(4～9)的化學結構

鑒于以上研究結果，我們以芳基釕(II)配合物[Ru(η6-傘花烴)(2-氨甲基吡啶-N,N)Cl]PF6為研究對象，研究其體外對4種人癌細胞系的毒性，以抗癌藥物順鉑為對照組，以期有所發現。

1 合成實驗

1.1 儀器與試劑

所用化學試劑均為市售產品，分析純，直接使用。采用X-4數字顯微熔點測定儀測定熔點(溫度未經校正)；采用Bruker DRX-400核磁共振波譜儀測定氫譜和碳譜，以SiMe4為內標；采用NICOLET iS10傅里葉紅外光譜儀測定4000～200 cm-1范圍內的紅外光譜。

1.2 合成方法

[(η6-cymene)RuCl(2-picolylamine-N,N)]PF6(1)的合成，室溫下，將二氯(對甲基異丙苯)釕(II)二聚體(0.212 g，0.33 mmol)懸浮于無水甲醇(50 mL)中，并一次性加入2-氨甲基吡啶(0.108 g，1 mmol)，攪拌3 h后過濾，濾液中加入NH4PF6(0.5 g，3.07 mmol)，攪拌5 min后采用旋轉蒸發儀減壓濃縮體積約15 mL，在277 K下靜置，待析出微晶后過濾收集產物，乙醚洗滌，甲醇-乙醚重結晶得到黃色晶體產物(0.206 g, 51.0% yield)。1H NMR譜圖給出以下特征信號：在δ 9.40～7.30范圍內出現的4個芳香族氫信號歸為吡啶環上氫信號，兩個dd耦合的芳烴質子信號歸為傘花烴芳環氫信號。δ 4.30～3.90范圍內的多重峰為N-CH2-質子信號峰。13C NMR譜圖給出16個碳信號峰，包括11個芳香碳和5個脂肪碳，δ 81.70為 CH2-NH2碳信號峰。紅外光譜給出3500～3100 cm-1范圍內的寬峰，為N-H伸縮振動吸收帶。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.11 (d,J=5.4 Hz, 1H), 8.30～7.75 (m, 1H), 7.70～7.40 (m, 2H), 7.10～6.80 (m, 1H), 5.90 (d,J=5.8 Hz, 1H), 5.84 (d,J=5.9 Hz, 1H), 5.71 (d,J=5.9 Hz, 1H), 5.65 (d,J=5.8 Hz, 1H), 4.55～4.30 (m, 1H), 4.25～3.95 (m, 2H), 2.90～2.60 (m, 1H), 1.95 (s, 3H), 1.11 (d,J=6.8 Hz, 6H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 161.23, 154.54, 139.13, 124.87, 121.14, 103.05, 98.02, 84.84, 83.07, 82.27, 81.70, 52.04, 30.23, 22.32, 21.42, 17.63; IR (KBr) νmax(cm-1): 3438, 3334, 3227, 2973, 1613, 1469, 1441, 1386, 1312, 1165, 1105, 1037, 881, 839, 764, 558. Anal. Calcd for C22H39ClF6N2PRu: C, 43.1; H, 6.41; N, 4.57. Found: C, 42.96; H, 6.25; N, 4.41。

2 活性測試

2.1 材 料

HepG2(HCC)、Hela(cervical)、A549(lung)、MCF-7(breast)細胞系；RPMI1640培養基、DMEM/H培養基、PBS、75 cm2培養瓶、96孔細胞培養板均購自CORNING；MTT、0.25% Trypsin-EDTA、Pen Strep均購自GIBCO；Foetal Bovine Serum購自BIOLOGICAL INDUSTRIES；DMSO購自AMRESCO；SNAYO CO2培養箱；HEALES MB-580酶標儀。

2.2 采用 MTT 法測定抗腫瘤活性

將釕配合物1及順鉑分別用DMSO溶解，配制成100 mg/mL后于4 ℃下儲存備用。將MTT用磷酸鹽緩沖鹽(PBS，pH=7.2)配成5 mg/mL溶液后通過0.22 μm微孔過濾器過濾備用。

將腫瘤細胞(HepG-2、Hela、A549、MCF-7)懸浮于10%的胎牛血清中于DMEM/H培養基常規培養(37 ℃，5% CO2)。用于實驗的細胞保持在對數增長期。0.25% Trypsin-EDTA消化收集細胞并計數，以每毫升4×104個細胞數接種于96孔細胞培養板，每孔200 μL，孵育24 h使貼壁。測試化合物用培養液和DMSO稀釋成不同濃度，每個濃度設6個平行孔，與癌細胞于CO2培養箱中共同孵育48 h。每孔加入濃度為0.5 mg/mL的MTT (50 μL)，再孵育4 h后，輕輕吸去上清。每孔加入150 μL DMSO，搖床振搖至充分溶解后用酶標儀在490 nm處檢測并記錄各孔吸光度值。抑制率按照以下計算公式計算：抑制率%=(化合物組平均OD值-對照組平均OD值)/對照組平均OD 值×100%。SPSS 進行回歸分析計算IC50值，實驗重復3次，IC50最終結果以3次實驗平均值±SD值表示。

2.3 活性測試結果

文章采用MTT法檢測有機金屬釕試劑1對人癌細胞系HepG-2(HCC)、A549(lung)、Hela(cervical)、MCF-7(breast)的體外抑制活性，以對臨床抗癌用藥物順鉑為對照組。將以上細胞系與不同濃度的化合物1和順鉑共同孵育48 h，結果表明有機金屬釕化合物1對HepG-2、A549和Hela的抑制作用呈劑量依賴關系，濃度在10 μg/mL以下時效果不如順鉑，濃度在100 μg/mL左右時，效果逐漸與順鉑相當；對MCF-7(breast)幾乎無抑制作用，不如順鉑(表1)。

表1 有機金屬釕化合物1和順鉑與 HepG-2(HCC)、A549(lung)、Hela(cervical)、MCF-7(breast)共同孵育48 h后所測的半數最大抑制濃度(IC50)值

3 結 論

本文合成并表征了芳基釕(II) 配合物[Ru(η6-傘花烴)(2-氨甲基吡啶-N,N)Cl]PF6，首次測定了其體外對4種人癌細胞系HepG2(HCC)、Hela(cervical)、A549(lung)、MCF-7(breast)的抑制作用，以臨床用藥順鉑為對照。測試結果表明其對 MCF-7 (breast) 幾乎無抑制作用，對HepG2(HCC)、Hela(cervical)、A549(lung)的抑制作用呈劑量依賴關系, 濃度在100 μg/mL左右時，抑制效果逐漸與順鉑相當，說明該配合物具有很好的抗腫瘤作用，具有進一步研究的價值。