LiFePO4改性電極同時測定抗壞血酸、多巴胺和尿酸*

梁亞鳴，袁紅雁

(四川大學化學工程學院，四川 成都 610065)

人體健康與體液中各種生物分子的含量密切相關。抗壞血酸(AA)是人體必需的營養物質，當AA不足時，會發生壞血病或內臟出血，危及生命[3-4]。多巴胺(DA)作為一種神經遞質，可以調節中樞神經系統的生理功能，其含量與人類情緒和各種神經疾病有關，例如帕金森病、精神分裂癥和艾滋病病毒等[5-6]。尿酸(UA)也是人體血清和尿液中重要的生物分子。尿酸值過高會導致痛風和高尿酸血癥等疾病[7-8]。通常，DA在人體內的濃度為10-8～10-6mol·L-1，AA的濃度是DA的10～100倍，UA的含量為2.4×10-4～5.2×10-4mol·L-1[9]。因此，快速、有選擇性、靈敏地檢測這三種生物分子有利于生物學和臨床醫學的研究。電化學法具有靈敏度高、易小型化、成本低、操作簡便等優點，在眾多檢測方法中脫穎而出。然而，由于AA、DA和UA通常在電極的同一表面上具有相似的陽極峰，傳統的修飾電極如GCE，大多不能同時有效的識別共存的AA、DA和UA。為了解決這一問題，人們研究了多種傳感材料來制備化學修飾電極，碳材料與金屬或金屬氧化物混合后由于其良好的導電性，可以達到較低的檢測限和較寬的線性范圍。此前，本課題組利用另一種鋰離子電池材料LiCoO2[10]與石墨混合修飾玻碳電極，實現了在AA和UA存在下對DA的快速靈敏檢測，但高濃度的AA仍有弱的陽極峰，無法與DA分離。因此，本文研究了另一種電池材料LFP制備電化學傳感器，以期實現DA、AA和UA的同步、靈敏檢測。

本文將LFP與石墨粉末混合用來修飾GCE。制備的LFP-G/GCE實現同時測定AA、DA和UA。用循環伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)可以很好地區分這三種化合物在LFP-G/GCE表面的氧化峰。LFP和石墨粉末都是工業化的材料，容易獲得。結果表明，LFP-G/GCE對實際樣品中AA、DA和UA的回收率均達到了滿意的水平。此外，還可以檢測人血清中UA的原始含量，說明該傳感器在臨床診斷中具有潛在的應用價值。

1 實 驗

1.1 試劑和儀器

LFP，德陽威旭鋰電科技有限公司；98%鹽酸多巴胺(DA)和(AA)，Alfa Aesar；UA(99%)，大連美侖生物；99.8%石墨粉，上海膠體化工廠。實驗中使用的其他試劑均為分析級，未經進一步純化。不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)由0.1 M K2HPO4和0.1 M KH2PO4配制而成。每次實驗使用的AA、DA、UA和PBS溶液分別現配制。

循環伏安法(CV)和差微分脈沖伏安法(DPV)在CHI660e電化學工作站進行。電化學阻抗譜(EIS)在Autolab PGSTAT 302電化學工作站進行。X射線衍射圖在DX-2700B型X射線粉末衍射儀Cu Kα輻照下收集。X射線光電子能譜(XPS)由Kratos XSAM 800光譜儀獲得。掃描電子顯微鏡(SEM)圖像由日立S4800獲得。所有的電化學實驗都是在三電極體系下進行的，以裸GCE(d=3.0 mm)或改性GCE作為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑(Pt)電極(d=3.0 mm)作為輔助電極。

1.2 LFP/GCE和LFP-G/GCE的制備

10 mg LFP粉末均勻分散于1 mL水和異丙醇(4:1)混合溶液中，加入20 μL Nafion (5%)，得到LFP懸浮液。用同樣的方法制備了不同質量比(20:1、10:1、5:1、3:1)的LFP-G懸浮液。分別用0.3 μm和0.5 μm氧化鋁粉對GCE表面進行拋光，并用去離子水進行超聲波清洗。將5 μL相應懸浮液滴于清潔的GCE表面，在室溫下自然干燥，制備LFP/GCE和LFP-G/GCE傳感器。LFP具有特定的氧化還原峰，它會掩蓋被分析物的氧化還原峰，從而影響定量分析結果。因此，制備的LFP/GCE和LFP-G/GCE在空白PBS中通過CV法循環20個周期，確保在所有定量分析之前獲得穩定的背景電流。

2 結果與討論

2.1 LFP-G/GCE對AA、DA和UA的電化學行為

首先用CV法比較了AA、DA和UA在裸GCE、LFP/GCE和LFP-G/GCE上的電化學行為(圖1a)。在裸GCE表面，AA在～0.14 V處出現不明顯的不可逆氧化峰，DA和UA的氧化峰分別在～0.27 V和～0.43 V。在LFP/GCE和LFP-G(5:1)/GCE電極上，AA、DA和UA分別在～0.07 V、～0.22 V和～0.36 V處有相似的陽極峰。三種分析物在LFP/GCE和LFP-G(5:1)/GCE上的陽極峰電位均低于裸GCE，說明AA、DA和UA在LFP/GCE和LFP-G(5:1)/GCE上發生了的氧化反應。此外，三種分析物在LFP-G(5:1)/GCE電極上的氧化峰電流(ip)是LFP/GCE電極上的兩倍，高于裸GCE電極，表明石墨粉的加入提高了電極的導電性，LFP-G(5:1)/GCE對這三種物質具有最靈敏的響應。以上結果還表明，LFP-G(5:1)/GCE對AA、DA和UA具有電催化和吸附作用，加速了分析物向LFP的電子轉移。如圖1b所示，DPV曲線顯示三種分析物的陽極峰分離良好，陽極電流隨DA、UA和AA的加入而增大，表明AA、DA和UA可以同時檢測。

圖1 裸GCE、LFP/GCE、LFP-G(5:1)/GCE在含有1000 μM AA、5 μM DA和50 μM UA的0.1 M PBS(pH 7.0)溶液中的

石墨的加入可以提高電極對AA、DA和UA的響應，因此在Fe[(CN)6]3-/4-溶液中探究了不同比例的石墨修飾電極的可逆性和導電性。圖2a表明，增加石墨含量可以降低改性層的電阻，提高導電性。圖2b顯示導電性的改善可以改善LFP-G/GCE的可逆性。圖3是AA、DA和UA在LFP-G/GCE表面的氧化過程。

圖2 不同的電極在5×10-3 mol·L-1Fe[CN6]3-/4-中(a)EIS和(b)CV曲線

圖3 LFP-G/GCE表面AA、DA、UA氧化過程示意圖

2.2 實驗條件的優化

為了達到定量分析的最佳條件，以DA為主要研究對象，優化了檢測的實驗條件，包括改性材料中石墨的比例、電極的負載質量和pH值。

由圖4a和圖4b可知，LFP與石墨的最佳質量比為5:1，電極負載質量為50 μg。三種分析物的陽極峰值電流(ipa)，電壓(Ep)與PBS 的pH值之間的關系如圖4c所示?？紤]到生理pH值接近中性pH值，所以選擇pH 7.0的PBS進行定量檢測。

圖4 不同負載量的LFP-G/GCE的△ip比較(a)；不同比例的LFP-G/GCE的ip/i0(b)；CV下電極在不同pH下的ip(c)和Ep(d)

2.3 LFP-G的形貌和結構

為了研究LFP的結構穩定性，我們觀察了未處理(LFP)、空白PBS(LFPB)中用CV法處理100圈以及在含200 μM DA(LFPDA)的PBS中循環100圈的LFP粒子的形貌。從圖5a的SEM可以看出，LFP呈短棒狀，長度約為400 nm。在空白PBS和含有DA的PBS中的CV循環不會導致LFP的任何形態變化(圖5b和圖5c)。但是，在LFPDA上發現了一些物質，這可能是由于LFP對分析物的吸附行為造成的，氧化產物不能立即解吸。氧化產物的覆蓋將占據分析物的吸附位置并抑制電流響應。

圖5 LFP(a)；LFP在空白PBS(LFPB)中用CV法處理100個循環(b)；LFP在含有200 μM DA(LFPDA)的PBS中用CV法處理100個循環(c)；LFP-GB和LFP-GDA的XRD圖譜(d)

圖5d中的X射線衍射(XRD)圖譜顯示了在PBS(LFP-GB)和含有DA(LFP-GDA)的PBS中CV 循環100次后LPF-G的晶體結構。兩者的結構完全符合LFP(JCPDS No.83-2092)和石墨(JCPDS No.01-1260)的標準卡片。26.5°處的峰屬于石墨的(002)晶面，其余為LFP。CV處理前后晶體結構無明顯變化，說明LFP的結構穩定性較好。

利用X射線光電子能譜(XPS)分析了LFP、LFPB和LFPDA的表面組成和價態。由于自旋軌道耦合，Fe的2p軌道被分成兩部分，圖6a中，位于～710 eV和～724 eV處的峰分別屬于Fe2+的Fe 2P3/2和Fe 2P1/2，而Fe3+具有較高的結合能，位于～712 eV和～726 eV處的峰屬于Fe 2P3/2和Fe 2P1/2。在含DA的PBS中CV循環后，LFPDA中Fe3+含量增加。O1s光譜表明，LFPDA表面的氧含量高于LFP，這可能是DA氧化產物在LFPDA表面吸附所致。此外，DA氧化還原過程中Li+的損失也可能促進Fe2+氧化為Fe3+。Li 1s光譜也證實了這一結論(圖6c)。Li+的損失可能加速DA在LFP表面的吸附。

圖6 LFP、LFPB和LFPDA的XPS光譜

2.4 DPV法測定AA、DA和UA

采用DPV技術同時檢測AA、DA和UA。在每次檢測中，僅連續添加一種分析物，另外兩種物質保持恒定。圖7顯示，AA、DA和UA的陽極峰分離良好，分別位于-0.035 V、～0.15 V和～0.29 V。圖7a顯示了AA在200.0～2000 μM范圍內與5.0 μM DA和50 μM UA共存的DPV滴定曲線；圖7c顯示了DA在10.0 nM～200 μM范圍內與0.50 mM AA和50 μM UA共存的DPV滴定曲線；圖7e顯示了UA在50.0 nM～400 μM范圍內與0.50 mM AA和5.0 μM DA共存的DPV滴定曲線。圖7b、圖7d和圖7f分別顯示了峰值電流與AA、DA和UA濃度的線性關系。AA對應的線性方程為ip,AA=0.01012×cAA+22.94(R2=0.9916)；DA為ip,DA=1.172×cDA+16.13(R2=0.9918)，UA為ip,UA=0.1957×cDA+17.43(R2=0.9932)。檢測限分別為156 μM、4.14 nM和0.186 μM(信噪比=3)。用LFP-G/GCE檢測AA、DA和UA的結果與文獻報道的結果進行了比較，總結在表1中。本研究所制備的電化學傳感器不僅可以同時檢測AA、DA和UA，而且與其他報道的結果相比，檢測限也較低。

圖7 0.1 M PBS(pH 7.0)對不同濃度AA(200.0～2000 μM)，5.0 μM DA和50 μM UA的LFP-G/GCE的DPV曲線；不同濃度DA(10.0 nM～200 μM)，500 μM AA和50 μM UA；以及(c)不同濃度UA(50.0 nM～400 μM)，500 μM AA和5.0 μM DA的LFP-G/GCE的DPV曲線；線性關系ip和(d)AA，(e)DA和(f)UA的濃度

表1 不同生物傳感器同時檢測AA、DA和UA

2.5 LFP-G/GCE的選擇性

血液和體液中除DA、UA、AA外，還含有多種離子、氨基酸等生物分子。用DPV和計時電流法(i-t)研究了不同物質的干擾。在Fe2+、Ca2+、Zn2+、Cl-、SO42-和葡萄糖、檸檬酸、葉酸、對乙酰氨基酚、甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、間苯二酚等有機分子存在時，對DA、UA、AA的檢測無明顯干擾，鄰苯二酚有輕微干擾(圖8)。這種良好的選擇性使LFP-G/GCE能夠檢測人體血清等真實樣品中的AA、DA和UA。

圖8 (a)LFP-G/GCE對甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、間苯二酚、鄰苯二酚、對乙酰氨基酚的選擇性。在0.1 M磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中添加700 μM AA(b)；10.0 μM DA(c)；20.0 μM UA和1 mM其它化學品(d)后LFP-G/GCE的安培曲線

2.6 人血清檢測

人體血液經10000 rmp/分離心15 min后取上清液，用0.1 M PBS(pH 7.0)稀釋50倍。首先檢測稀釋血清，觀察LFP-G/GCE能否識別血清中的三種分析物。然后，在稀釋血清中分別加入一定量的AA、DA和UA。檢測結果的計算和匯總見表2和表S1?；厥章试?6.6%～103%之間，相對標準偏差小于4%。稀釋血清中尿酸的濃度可檢測為～7.52 μM，原血清中尿酸的濃度計算為375 μM，與人體內尿酸的正常水平相對應。

表2 人血清中AA、DA、UA的回收率

3 結 論

本文將商業磷酸鐵鋰(LFP)與導電劑石墨簡單混合，改性GCE，實現了AA、DA和UA的高靈敏同時測定。LFP對三種分析物具有催化和吸附作用，提高了氧化還原峰電流，降低了檢測限。同時檢測時，LFP-G/GCE表面AA、DA和UA的線性范圍較寬，檢測限低于文獻報道的結果。該傳感器具有良好的選擇性。此外，LFP-G/GCE可用于實際樣品中UA的檢測，人血清中UA的濃度計算為375 μM，同時人血清中AA和DA的回收率令人滿意，表明LFP-G/GCE可用于臨床分析。