運動預處理對心肌缺血再灌注損傷老齡大鼠心肌的影響

李宏玉，尹 俠，張世強，朱路文，唐 強*

1黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱150001；

2黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱150040

心肌缺血是冠心病基本的病理、生理過程，盡早恢復缺血心肌的血流灌注能夠挽救缺血心肌，顯著提高治療效果；但心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）成為影響冠心病治療的重要因素。缺血預適應（ischemic preconditioning，IPC）是心肌保護的新概念，是MURRY等［1］于1986年首次提出，是迄今為止最有效的內源性心肌缺血保護方法［2-3］，其通過反復、短暫的缺血／再灌注刺激后，使心肌對之后更長時間缺血缺氧等刺激的耐受性增強，對心肌細胞產生一定的保護作用。有研究顯示，運動可以產生IPC樣類似的保護效應，運動預處理（exercise preconditioning，EP）作為一種生理性模仿缺血預適應的預處理方式，通過在缺血前進行適宜強度、重復多次的運動干預，可以模擬缺血預處理的模式來增強心臟對缺血、缺氧的耐受能力，引起心肌保護效應［4-6］。這可為防治冠心病提供新思路和新途徑，與中醫“治未病”的疾病防治準則相一致。流行病學調查發現，運動訓練能減少心臟疾病危險因素，降低冠心病的發生率和病死率［7］。因此，本研究通過建立離體心肌缺血／再灌注模型探討運動預處理誘導老齡大鼠心肌發揮IPC的保護作用機制，為臨床應用提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取SPF級雄性SD老齡大鼠75只，鼠齡：15～18個月，體質量（450±20）g，購買于黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心［動物使用許可證：SYXK（黑）2019002］。飼養環境：通風良好、自由飲水、人工光照12 h／12 h（明暗交替）、溫度（21±2）℃、濕度（60±5）%的標準屏障環境。

1.2 主要儀器與試劑

動物實驗跑臺（徐州利華電子公司，ZH-PT型）；Langendorff離體心臟灌流實驗系統（江蘇賽昂斯生物技術有限公司）；-80℃超低溫冰箱（日本Panasonic公司）；BioNex臺式多導生理信號記錄儀（美國Mindware公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（美國Sigma公司）；無水乙醇（天津市天力化學試劑公司）；多聚甲醛（天津光科密歐有限公司）；肝素鈉注射液（天津生物化學制藥有限公司，規格：1萬U／mL）。

2 實驗方法

2.1 動物篩選及分組

采用電動動物實驗跑臺進行訓練，1次／d，共訓練3 d。跑臺參數如下：①時間：30 min／d；②速度：15 m／min；③坡度：0°；④電擊強度：1.0 mA。淘汰標準：1次訓練中電擊次數＞5次和／或1次電擊時間＞1 s的大鼠。跑臺訓練完成后，淘汰15只大鼠，共納入60只配合度較高、體質較好的大鼠。按照隨機數字表法分為對照組（Con組）、缺血再灌注模型組（IR組）、運動預處理＋缺血再灌注組（EP＋IR組）、缺血預適應組（IPC組）、運動預處理＋缺血預適應組（EP＋IPC組），每組12只。

2.2 干預方法

Con組、IR組、IPC組不做特殊運動干預；EP＋IR組、EP＋IPC組接受運動預處理干預，具體如下：采用電動動物實驗跑臺進行梯度運動訓練，1次／d，5 d／周，共訓練6周。跑臺參數如下：①時間：起始15 min／d，每3 d時間增加5 min／d，直至時間增至60 min／d時不再變化；②速度：20 m／min；③坡度：0°；④電擊強度：1.0 mA。

2.3 模型制備

選取1%戊巴比妥鈉溶液經腹腔注射（40～50 mg／kg）對大鼠進行麻醉［8］，為防止血管凝血選取肝素鈉溶液經腹腔注射（100 U／100 g）。麻醉后，將大鼠固定、開胸、迅速取出心臟，用1號線將離體心臟固定在Langendorff離體灌流裝置上，采用95%O2和5%CO2混合氣體及37℃Krebs-Henseleit（K-H）灌流液恒溫恒壓灌流，制備老齡大鼠離體心肌缺血再灌注動物模型。

2.3.1 Con組模型 當心臟離體之后，快速主動脈插管進行離體灌流，持續平衡灌注180 min，不參與缺血處置［9-10］。

2.3.2 IR組模型 預灌注平衡20 min，然后保持心臟溫度恒定在37℃，通過控制灌流設備的三通閥，使全心缺血40 min后，再復灌120 min。

2.3.3 EP＋IR組模型EP＋IR組大鼠心臟離體后，模型制備方法同IR組。

2.3.4 IPC組模型IPC組大鼠心臟離體后平衡灌注20 min，給予3次缺血預處理（短暫缺血5 min，再灌注10 min），之后缺血40 min，再復灌120 min。

2.3.5 EP＋IPC組模型EP＋IPC組大鼠心臟離體后，模型制備方法同IPC組。

2.4 取材

2.4.1 灌流液取材 各組大鼠在停灌注前（穩定灌注20 min）和再灌注后30、60、120 min時，用2 mL EP管留取1 min心臟灌流液，并用量筒準確測量灌流液體積，隨后離心，取上清保存于-20℃冰箱中以備LDH活性檢測。

2.4.2 心肌組織取材 各組大鼠離體心臟在灌流結束后取下全心，每組隨機選取6只用于心肌梗死面積觀察。4℃PBS溶液沖洗心臟表面及內腔血液并用濾紙吸干水分，-20℃冷凍20 min后進行染色。6只大鼠心肌組織用生理鹽水洗凈，經液氮速凍后，置于－80℃冰箱保存用于超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測。

2.5 觀察指標

2.5.1 心臟功能評價 心臟恢復跳動后，連接生物信號采集系統，分別采用以下指標評價大鼠心功能：①停灌注前（穩定灌注20 min）和再灌注后30、60、120 min時的心率（heart rate，HR）；②左心室舒張壓（left ventricular developed pressure，LVDP）；③左心室壓力最大上升速率（+dp／dtmax）；④左心室壓力最大下降速率（-dp／dtmax）。⑤接取1 min心臟灌流液，測定體積及冠脈流量（coronary flow，CF）。

2.5.2 TTC染色法觀察各組心肌梗死面積 灌流結束后取材，隨后放置于-20℃冰箱冷凍30 min，配制1% TTC染色液后置于37℃恒溫箱中避光預熱30 min。隨后沿心臟縱軸進行組織切片，連續切成厚度約2 mm相同的6片心肌組織。孵育、定色、拍照、用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0來測定梗死區結果分析，梗死面積用梗死區（蒼白區）面積／全心面積（磚紅色區＋蒼白區）的百分比表示。

2.5.3 比色法檢測乳酸脫氫酶活性、心肌組織含量及活力

2.5.3.1 乳酸脫氫酶活性 取再灌注后120 min留取的2 mL灌流液（-80℃保存），按檢測試劑盒（可見光比色法）說明書測定灌流液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性。

2.5.3.2 心肌組織含量及活力 取出－80℃冰箱保存的心肌組織，分別按照檢測試劑盒說明書測定MDA含量及SOD活力。

2.6 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布，數據以（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，組內不同時間點比較采用重復測量方差分析，兩兩比較方差齊用LSD-t檢驗，方差不齊則用Tamhane"s T2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 5組心功能比較

見表1。

3.2 5組大鼠心肌梗死面積比較

5組大鼠心肌組織經TTC染色后，非梗死區域呈磚紅色，梗死區域呈蒼白色。Con組無缺血模型制備，故無梗死面積變化；與Con組比較，IR組心肌梗死面積明顯增大（P＜0.05）；與IR組比較，EP＋IR組、IPC組、EP＋IPC組 心 肌 梗 死 面 積 明 顯 縮 小（P＜0.05）；與EP＋IR、IPC組比較，EP＋IPC組心肌梗死面積明顯更小（P＜0.05）；EP＋IR組和IPC組比較，心肌梗死面積差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

3.3 5組大鼠LDH活性、MDA含量和SOD活力比較

3.3.1 5組大鼠心臟再灌注120 min灌流液LDH活性水平比較 見表3。

3.3.2 5組大鼠心肌組織MDA含量、SOD活性比較 見表4。

4 討 論

MIRI是一系列復雜的病理、生理變化，損傷機制具體包括線粒體損傷、細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激等［11-12］。運動預適應對心肌細胞保護作用的機制較為復雜，目前認為，其主要與運動誘導心肌細胞適應性保護有關。

4.1 運動預處理可以有效改善MIRI老齡大鼠心臟功能

再灌注后心律失常是心肌缺血再灌注損傷的重要表現之一。如何預防或減少心肌缺血再灌注損傷是臨床研究的熱點之一。本研究結果顯示，與IR組比較，EP＋IPC組灌注后HR、LVDP、±dp／dtmax、CF等心功能指標均明顯提高，這提示，缺血再灌注前給予一定的運動訓練以及缺血預處理能有效提高MIRI老齡大鼠心臟功能。與EP＋IR、IPC組比較，EP＋IPC組灌注后HR、±dp／dtmax、CF均明顯升高，這提示，在缺血再灌注前給予一定程度的運動訓練，能夠有效增強MIRI老齡大鼠心肌缺血預適應誘導的心功能。這與孫華偉［13］研究發現速度遞增的跑臺訓練能明顯改善心功能；王立中等［14-15］研究發現冠心病患者及經皮冠狀動脈介入治療術后出院患者，接受適宜強度的運動訓練可以增強患者的運動耐力、改善心臟舒張功能，并降低再入院率的結果

相似。但其究竟是如何發揮心臟保護作用的，目前尚未形成統一結論。有研究顯示，進行一定強度的EP可以增強心臟IPC的保護效應，通過提高心肌對抗缺血缺氧的耐受程度，誘導改善心臟收縮舒張功能，從而發揮心肌保護作用［16-17］。

表1 5組心臟功能指標比較（±s）Table 1 Comparison of cardiac function indexes in five groups（±s）

注：與Con組同一時間點比較，1）P＜0.05；與IR組同一時間點比較，2）P＜0.05；與EP+IR組同一時間點比較，3）P＜0.05；與IPC組同一時間點比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group at the same time,1)P＜0.05;Compared with the IR group at the same time,2)P＜0.05;Compared with the EP+IR group at the same time,3)P＜0.05;Compared with the IPC group at the same time,4)P＜0.05.

+dp／dtmax／（Kpa／s）3 083.5±160.7 2 461.9±92.3 2 317.1±309.6 2 024.2±175.3 2 801.4±161.91）802.0±98.91）782.2±81.71）759.6±170.21）2 919.1±179.0 1 395.6±187.22）1 285.2±242.32）1 302.6±131.32）2 922.3±165.1 1 386.2±169.52）1 302.1±264.92）1 310.2±143.22）3 058.6±130.02）1 791.7±127.42）3）4）1 761.6±286.72）3）4）1 658.7±77.12）3）4）組別n Con組12 IR組12 EP＋IR組12 IPC組12 EP＋IPC組12時間再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min HR／（次／min）300.2±17.9 256.0±24.8 246.5±14.6 236.6±12.8 277.5±16.21）107.4±16.11）99.9±11.71）106.3±17.51）285.3±19.7 133.4±13.32）119.3±13.72）132.4±17.42）285.8±17.4 136.9±14.72）120.5±12.62）134.2±16.92）284.2±18.2 185.8±16.22）3）4）166.9±18.62）3）4）183.5±21.42）3）4）LVDP／mm Hg 111.4±8.6 78.8±6.6 69.1±8.3 63.8±9.7 98.0±6.61）25.2±11.01）30.2±7.21）25.9±15.21）103.8±7.0 52.5±5.62）53.6±10.02）45.4±7.82）105.3±6.3 54.6±6.12）53.2±12.22）44.6±10.22）113.1±13.42）69.6±11.22）3）4）62.5±12.42）56.9±11.22）-dp／dtmax／（Kpa／s）2 365.2±96.9 1 853.3±220.4 1 827.1±150.7 1 684.2±158.7 2 292.9±172.71）837.4±184.91）801.5±131.91）844.5±95.61）2 315.2±180.3 1 154.6±164.02）1 176.8±155.42）1 211.4±151.32）2 308.1±163.2 1 138.6±163.92）1 169.3±156.32）1 208.3±147.82）2 309.6±182.4 1 578.2±156.72）3）4）1 677.7±76.72）3）4）1 525.5±133.02）3）4）CF／（mL／min）9.4±0.9 7.9±0.5 7.6±0.5 6.4±0.7 9.3±0.41）5.6±0.51）3.8±0.51）3.2±0.91）9.4±0.7 6.8±0.42）5.2±0.52）4.2±1.02）9.3±0.4 6.6±0.32）5.3±0.72）4.1±0.72）9.7±0.8 7.4±0.62）3）4）6.9±0.72）3）4）5.6±0.82）3）4）

圖1 5組大鼠心肌梗死面積TTC染色結果Figure 1 TTC staining results in the area of myocardial infarction in five groups

表2 5組大鼠心肌梗死面積比率比較（±s）Table 2 Comparison of myocardial infarction areas ratio（±s）

表2 5組大鼠心肌梗死面積比率比較（±s）Table 2 Comparison of myocardial infarction areas ratio（±s）

注：與Con組比較，1）P＜0.05；與IR組比較，2）P＜0.05；與EP＋IR組比較，3）P＜0.05；與IPC組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group,1)P＜0.05;Compared with the IR group,2)P＜0.05;Compared with the EP+IR group,3)P＜0.05;Compared with the IPC group,4)P＜0.05.

心肌梗死面積比率／%0 24.35±0.491）13.88±0.322）13.91±0.402）10.07±0.172）3）4）組別Con組IR組EP＋IR組IPC組EP＋IPC組n66666

表3 5組大鼠灌流液中LDH活性水平比較（±s）U／LTable 3 Comparison of LDH activity levels in five groups（±s）U／L

表3 5組大鼠灌流液中LDH活性水平比較（±s）U／LTable 3 Comparison of LDH activity levels in five groups（±s）U／L

注：與Con組比較，1）P＜0.05；與IR組比較，2）P＜0.05；與EP＋IR組比較，3）P＜0.05；與IPC組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group,1)P＜0.05;Compared with the IR group,2)P＜0.05;Compared with the EP+IR group,3)P＜0.05;Compared with the IPC group,4)P＜0.05.

組別Con組IR組EP＋IR組IPC組EP＋IPC組n66666 LDH活性51.679±7.410 152.974±14.8301）105.923±13.3132）110.456±13.6132）78.361±16.8042）3）4）

表4 5組大鼠心肌組織MDA含量、SOD活力比較（±s）nmol／mgprotTable 4 Comparison of MDA and SOD content of myocardial tissue in five groups（±s）nmol／mgprot

表4 5組大鼠心肌組織MDA含量、SOD活力比較（±s）nmol／mgprotTable 4 Comparison of MDA and SOD content of myocardial tissue in five groups（±s）nmol／mgprot

注：與Con組比較，1）P＜0.05；與IR組比較，2）P＜0.05；與EP＋IR組比較，3）P＜0.05；與IPC組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group,1)P＜0.05;Compared with the IR group,2)P＜0.05;Compared with the EP+IR group,3)P＜0.05;Compared with the IPC group,4)P＜0.05.

組別Con組IR組EP＋IR組IPC組EP＋IPC組n66666 MDA含量3.498±1.322 7.199±0.9901）5.910±1.090 6.866±1.076 3.706±0.2502）3）4）SOD活力530.278±15.787 414.143±81.4731）437.787±31.574 429.803±49.081 522.346±13.5692）3）4）

4.2 運動預處理可以有效減少MIRI老齡大鼠心肌梗死面積

TTC染色液可與正常心肌組織中的脫氫酶產生反應而呈深紅色，但由于梗死心肌組織內脫氫酶活性急劇下降，不能與染色液發生反應，故不會產生變化而呈蒼白色。本研究結果顯示，與Con組比較，IR組出現明顯的蒼白色梗區，這直觀地從形態學角度驗證了本研究MIRI模型制備成功。與IR組比較，EP＋IR組、EP＋IPC組心肌梗死面積明顯減小，這提示，在缺血再灌注前給予一定程度的運動訓練能夠大幅改善心肌損傷程度，縮小心肌梗死面積，達到保護心肌的效果。這與FRASIER等［18-20］研究發現規律的運動訓練可以減輕缺血再灌注后心律不齊、心肌頓抑、細胞凋亡以及心臟冠狀動脈血管反應異常等情況造成的心肌損傷，縮小心肌梗死面積的結果一致。PARRA等［21-22］研究認為這可能與運動訓練可以誘導心肌缺血耐受，提高心肌組織對缺血的預適應，從而減少心肌梗死面積有關。

4.3 運動預處理可提高MIRI老齡大鼠心肌細胞能量代謝及抗氧化能力

本研究結果顯示：與EP＋IR、IPC組比較，EP＋IPC組LDH活性水平更低。這提示在缺血再灌注前給予一定程度的運動訓練，可以下調MIRI老齡大鼠的LDH含量，從而進一步發揮心肌保護作用。這與郭光明［23］研究發現規律的跑臺運動訓練可下調大鼠血清中LDH含量的結果一致。LDH是機體能量代謝過程中重要的酶，它廣泛存在于心肌組織中，當心肌組織受到破壞發生缺血壞死等情況時，血液中LDH活性水平將激增［24］，LDH活性水平增高將會導致心肌細胞進一步損傷。

此外，本研究結果顯示，與IR組比較，EP＋IPC組心肌組織中SOD活力明顯升高，MDA含量明顯降低。這提示，在缺血再灌注前給予一定程度的運動訓練，可以提高心肌抗氧化能力，能更有效地誘導老齡大鼠心肌IPC的心臟保護效應。在心肌抗氧化能力方面，SOD和MDA是反映氧化應激程度的2個重要指標。SOD活力的強弱可以反映機體的抗氧化能力，MDA含量可以反映機體內發生脂質過氧化的程度［25］。缺血再灌注后氧化應激促進了氧化劑的積累，降低了心肌細胞的自由基清除能力，SOD活力弱化、MDA大量增加，導致心肌細胞損傷［26］。本研究IPC組心肌組織MDA含量、SOD活力較IR組無明顯差異，這提示老齡大鼠心肌IPC誘導心肌缺血耐受的敏感性不足。而與EP＋IR、IPC組比較，EP＋IPC組心肌組織中MDA含量明顯降低，SOD活力明顯升高，這提示，在缺血前進行運動干預可以使機體產生抗氧化能力的適應，使機體產生適量的自由基刺激抗氧化酶的活性，促進機體SOD活力提高，降低MDA含量，從而上調機體抗氧化水平［27］。

5 小 結

運動預處理可誘導老齡大鼠心肌IPC保護作用，改善老齡大鼠心臟功能，減小心肌梗死面積，減輕心肌細胞損傷。運動預處理對缺血再灌注損傷心肌具有保護作用，可能與其降低心肌缺血再灌注時心肌LDH活性、MDA含量，提高SOD活力，增強心肌抗氧化能力有關。