茶皂素提取純化技術及生物活性研究進展

杜金婷，李 雁，張 雁，駱碧群，林 江，王佳佳，廖 娜

（1.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610；2.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；3.廣東星匯生物科技有限公司，廣東 龍川 517323）

茶皂素又名茶皂甙，是一類齊墩果烷型五環三萜類皂甙混合物，也是良好的天然表面活性劑和小分子生物活性物質，廣泛存在于山茶科、山茶屬植物的根、莖、葉、花、果、籽中，尤其以茶籽中含量最多［1-2］。油茶是世界四大木本油料植物之一，其中的茶籽富含茶皂素，被認為是一種寶貴的自然資源，且因其經濟和環境效益較高而越來越受到關注。油茶是我國特有的油料樹種，在華南地區廣泛種植，每年可產出260 多萬t 油茶籽，經榨油后可產生約140 多萬t 油茶粕。但受提取純化技術的限制，市場流通的茶皂素純度較低，致使現有的產業價值低于其實際商品價值。

目前，茶皂素的主要提取方法為水提法、有機溶劑法等傳統方法，然而傳統方法提取時間長、純度低，無法滿足食品醫藥等行業的要求。近年來出現了新興的輔助提取法，如微波提取法、超聲提取法等，在提高產品純度的同時可縮短提取時間，提高提取效率，但因成本高和初期投資較大而難以大規模應用。由此可見，為提升茶皂素行業經濟價值，尋找簡單高效的提取純化技術顯得尤為重要。

茶皂素具有發泡、乳化、分散等表面活性作用，還有抗菌、胃腸保護、抗癌、降血脂等生物活性［3-5］，在醫藥、農業、工業和環境保護等領域具有廣闊應用前景。茶皂素是一類混合物，目前國內對茶皂素生物活性的研究多停留在皂苷混合物層面上，并未對其中已報道的77 個單體茶皂苷的生物活性進行研究。此外，在進行生物活性研究上，缺乏對作用機理和構效關系的研究，因此限制了茶皂素在生物醫藥等行業的運用。此外，目前國內外對茶皂素的研究僅在少部分茶樹種類中開展，對未開發或者較少研究的茶樹種類中的茶皂素生物活性、構效關系和作用機理研究較少，這將是未來研究的重要方向。

本文對茶皂素的提取純化技術及生物活性進行綜述，以期為新型提取純化方法的開發提供理論參考依據，同時為茶皂素開發和油茶粕的綜合利用提供基礎。

1 茶皂素的理化性質和結構

純茶皂素為乳白色或淡黃色無定形粉末，是一種非離子型表面活性劑，平均分子式為C57H90O26，相對分子質量在1200～2800，熔點為224℃，pH 值為5.0～6.5，表面張力為47～59 N/m［6］。茶皂素吸濕性強，有強起泡能力；極性較大，易溶于含水甲醇、含水乙醇，以及冰醋酸、醋酐、吡啶等，難溶于無水甲醇、乙醇，不溶于乙醚、丙酮、苯、石油醚等有機溶劑；茶皂素能與醋酸鉛、氫氧化鋇等反應析出沉淀物［7］。茶皂素由于在C-21 位上連α、β 不飽和共扼雙鍵，因此在215 nm 波長處對紫外光有最大吸收峰，可作為茶皂素的特征吸收峰用于結構鑒定。此外，茶皂素能夠與香草醛-硫酸進行顯色反應，在545 nm波長處有特征吸收峰，由此可以對其進行定量測定［8］。

茶皂素由疏水性配基、親水性糖體和有機酸三部分組成，其配基是β-香樹素衍生物，目前從茶籽中分離鑒定出7 種皂苷配基，這7 種配基的區別在于A 環上C-23、C-24 及E 環上C-21的連接基團不同。茶皂素結構中的糖體主要包括葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖與半乳糖，與配基環上的羥基以甙鍵式相結合。有機酸主要由當歸酸、惕各酸、醋酸和肉桂酸組成，茶皂素配基與有機酸的結合形式是配基環上的羥基與有機酸結合成酯。研究表明，茶樹品種及其生長環境會影響茶皂素的種類，即使同一棵茶樹不同部位其結構都會有較大差異［9］，這與配基和糖體相關聯，而造成如此差異主要是由于茶皂素C-3、C-4、C-16、C-16、C-21、C-22、C-23、C-28 位上取代基的多樣性。

2 茶皂素提取技術

茶皂素是茶籽中的重要生物活性成分，1931年青山次郎開始開展茶皂素研究，但由于其結構復雜性導致茶皂素提取困難［10］。傳統提取方法有水提法和有機溶劑法，近年來輔助提取法、閃式提取法、生物提取法和雙水相提取法等新方法也備受關注。

2.1 微波輔助提取法

微波輔助提取是通過離子傳導和偶極旋轉直接作用于植物分子，使能量在樣品和溶劑中快速傳遞，然后產生分子運動和熱促使物質分離［11］。表1 列舉了近年來采用微波輔助提取茶皂素的研究結果。He 等［12］對比了微波輔助提取與常規提取茶皂素的提取效果，發現微波輔助提取法將提取時間從6 h 降低到4 min，且節省約50%乙醇使用量。微波輔助法能夠有效提升提取效率，但由于初期設備投資高和生產過程輻射較大，目前仍處于實驗室階段，未來可通過結合連續多級逆流等提取工藝以應用于工業大生產［15］。

2.2 超聲波輔助提取法

超聲波作用于液體可使液體內產生空化效應，強大的壓力使得細胞壁破裂，同時超聲波產生的振動可加速胞內物質釋放、擴散和溶解，有效提高物質提取速率并保持生物活性不變［16］。表2 列舉了近年來采用超聲波輔助提取茶皂素的研究結果。超聲波與傳統提取技術結合提取茶皂素能大幅縮短提取時間，降低能耗，且茶皂素產品純度高、質量好。但超聲波的強大作用力也造成雜質溶出，從而對產品后期純化造成影響，此外超聲波的使用會使人體出現不適反應，這限制了其大規模應用［7］。

表1 微波輔助提取茶皂素工藝對比Table 1 Comparison of microwave-assisted extraction processes of tea saponin

表2 超聲波輔助提取茶皂素工藝對比Table 2 Comparison of ultrasonic-assisted extraction processes of tea saponin

2.3 超臨界萃取法

超臨界萃取是天然產物萃取領域的關鍵技術之一，在超臨界狀態下，將超臨界流體與待分離物質接觸，使其選擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小不同的成分依次萃取出來，然后借助減壓、升溫的方式使其變成普通氣體，從而達到分離提純的目的。伊文峰［20］采用乙醇為動態夾帶劑超臨界萃取茶皂素，得率為14.9%。呂曉玲等［21］利用CO2進行超臨界萃取茶皂素，在最佳萃取條件下收率為15.23%，純度達到78.65%，與乙醇浸提法相比，純度提高54%。超臨界萃取法具有效率高、工藝簡單和產品質量穩定等優點，但其設備昂貴和生產成本高等因素限制了其廣泛利用。

2.4 閃式提取法

閃式提取是在室溫和適當溶劑條件下，利用高速剪切力和攪拌力將植物原料粉碎至細微顆粒，并在局部負壓滲透作用下使有效成分迅速達到溶解平衡［22］。朱興一等［23］利用閃式提取器提取茶皂素，得率為21.09%，與傳統熱回流提取法相比，提取時間由6 h 縮短為40 s，提取溫度由70 ℃降到20～25 ℃。可見，閃式提取法有省時、溶劑消耗小和保護熱敏感成分等優點，但其單次處理量少且靈活處理能力較低［24］。

2.5 生物提取法

生物提取法包括酶解法和發酵法，酶解法是通過生物酶作用，使物質酶解從而分離出茶皂素［25］。目前較為常用的生物酶有綜合脂肪酶、纖維素酶和蛋白酶。張云豐等［26］利用酶解法提取茶皂素，提取率為86.86%。發酵法是通過接入酒精酵母對茶籽中豐富的糖類和蛋白質進行發酵［7］。王文杰等［27］利用酒精酵母進行二次發酵，結果茶皂素純度達到62.37%，且提取率為常規提取的5 倍以上。可見，生物提取法具有能耗低、提取效率高等優點，但溫度控制要求較高且可溶性雜質較多，因此目前在工業上的應用還較少。

2.6 亞臨界水提法

亞臨界水提取技術（Subcritical water extraction,SWE）是以亞臨界水為溶劑，通過改變水的介電常數，加快擴散速率，降低表面張力和黏度，達到提取極性或非極性溶質的一種新型技術［28］，被廣泛應用于中藥、植物、食品中生物活性物質提取。目前，已有利用SWE 提取多種天然活性成分的報道。Wu 等［29］利用SWE 提取茶皂素，在提取時間為30 min 的條件下，茶皂素提取率為74.21%。與此相似的是，李振海等［30］進行32 min 的亞臨界水提后，茶皂素提取率達到72.20%。可見，SWE 具有提取率高、耗時短、無有機溶劑殘留、環境友好等優點［31］，是一種極具潛力的綠色提取技術，在植物有效成分提取領域具有廣闊前景。

2.7 雙水相提取法

近年來，雙水相提取法（Aqueous two-phase extraction，ATPE）逐漸應用于小分子的提取和純化，其集提取純化于一體，可有效提升天然活性物質粗提物的提取率。目前，為提高提取效率，ATPE 多與超聲波和微波等輔助方法結合。Lin等［32］利用微波輔助雙水相提取香菇多糖，其提取率為11.16%，高于熱回流提取法的9.89%和超聲提取法的9.76%，同時該法大大提高提取效率且能選擇性提取各種多糖。可見，ATPE 法具有萃取選擇性好、環保、易規模化以及成本低等優點，是一種極具潛力的新型提取方法。目前，尚未有ATPE 應用于茶皂素提取的研究報道。

3 茶皂素分離純化方法

茶皂素可應用于多種領域，但目前市售的茶皂素產品雜質較多，需要純化后應用。目前常用的純化方法有酶解法、沉淀法、大孔樹脂法、凝膠色譜法、膜分離法等。

3.1 酶解法

酶解法是通過用選擇性高的生物酶對與茶皂素相互作用較強的多糖和蛋白質雜質進行水解去除，最終得到高純度茶皂素的一種純化方法。游瑞金等［33］采用生物酶-沉淀法純化茶皂素，通過工藝優化，得到最佳工藝條件，在組合酶（纖維素酶與糖化酶的比例為1 ∶2）用量為0.5%的條件下，可將茶皂素純度由67.5%提高到98.3%。周紅宇等［34］利用殼聚糖-蛋白酶聯用方法分離純化茶皂素，結果顯示，經過蛋白酶處理后，粗茶皂素中蛋白質去除率高達70%以上，且殼聚糖絮凝時茶皂素損失率顯著降低。酶具有專一性和高效性，因此采用酶解法的產品純度高和酶用量少，且對環境友好，但所需反應時間較長，在工業運用上仍需進一步研究。

3.2 沉淀法

沉淀法是通過加入沉淀劑，使茶皂素或雜質沉淀，而另一部分則留在提取液中，從而使得茶皂素與雜質分離。沉淀法所用的沉淀劑可分為兩類，一類是將茶皂素沉淀下來，包括有機溶劑沉淀劑（CHCl3、CH3COCH3、石油醚等）和金屬離子沉淀劑（鈣、鉛、銅、鋇等離子）；另一類是將雜質沉淀下來，主要有殼聚糖、KAl（SO4）2、PAC、PAM 以及 C2H5OH 等［35］。趙娟等［36］利用蛋白質、單寧等雜質不溶于丙酮的性質，采用丙酮為沉淀劑對茶皂素進行純化，產品純度從54.8%提高到87.20%。此外，王金元等［37］探究了殼聚糖和氧化鈣聯合沉淀的效果，純度有較大提升，但由于加入絮凝劑導致茶皂素損失率增加。沉淀法可選擇性沉淀雜質或所需成分，具有工藝簡單和易操作等優點，可適用于工業化大生產。但由于某些沉淀劑具有一定毒性，使得該法應用范圍受到限制。

3.3 凝膠色譜法

凝膠色譜法是利用分子篩原理分離不同分子量的化合物，再用不同濃度的洗脫劑洗脫，致使各成分按分子量遞減的順序依次被洗脫下來。姜偉等［38］采用Sephadex LH20 純化油茶餅粕乙醇提取物，得到純度為95.58%的油茶皂素。該法操作簡單、分離效果較好，但目前因其成本過高而難以在工業上推行。

3.4 高速逆流色譜法

高速逆流色譜（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是一種具有獨特優勢的液相分配色譜技術，近年來在天然活性成分分離純化領域發展迅速。吳佩娟等［39］利用未成熟羅漢果為原料，應用高速逆流色譜從總皂苷中分離羅漢果皂苷單體，在氯仿-甲醇-正丁醇-水（5∶6∶1∶4，V/V/V/V）的溶劑體系下，一次性制備4個化合物，純度分別為95.5%、98.2%、80.1%和97.6%。該方法具有操作簡單、樣品回收率高、損失少、避免樣品失活等優點，但成本較高，因此目前在工業上推廣應用仍需作進一步研究。

3.5 大孔樹脂法

大孔樹脂是一類聚合物吸附劑，目前應用大孔樹脂純化茶皂素的報道逐年增多（表3）。大孔樹脂具有吸附選擇性強、富集效果好及再生簡便等優點，被廣泛應用于天然產物分離純化。大孔樹脂法能顯著提升茶皂素純度，但也存在原料預處理難度大、提純后產品有機殘留高、樹脂使用壽命短等問題。因此，目前該技術在批量化生產上還不夠成熟［43］，工業化生產仍需完善。

表3 大孔樹脂純化茶皂素的工藝對比Table 3 Comparison of macroporous resin purification processes of tea saponin

3.6 膜分離法

膜分離技術是指不同粒徑分子的混合物在通過半透膜時，實現選擇性分離的技術。膜分離技術中，根據膜孔徑大小可以實現不同程度的分離、純化，具體可分為微濾、超濾、納濾、反滲透、氣體分離、電滲析等［44］。顧姣等［45］利用10 ku改良纖維素復合膜對茶皂素進行分離提純，茶皂素純度可達84.16%。程軼群等［46］在0.05 μm 孔徑、0.1 MPa 壓力和1%料液質量分數下純化茶皂素，產品純度由50%提高到83%。近年來，純化技術聯合使用成為了新的研究方向，例如，微濾-超濾組合工藝、膜分離與大孔樹脂結合等。孟維等［47］采用微濾-超濾組合工藝對純度為70%左右的粗茶皂素水溶液進行精制，經過優化，茶皂素純度提高到91.8%。綜上所述，膜分離具有低能耗、效率高、條件溫和及易操作等優點，但在操作過程中，膜會出現堵塞、污染和過濾速度慢等問題，解決這些問題將是膜分離走向工業化的關鍵節點。

4 茶皂素的生物活性

4.1 抗菌活性

茶皂素在體外、體內均具有抗菌作用，對細菌、真菌均具有良好的抗菌活性。目前，由于抗生素耐藥性，使新型抗細菌化合物的需求日益增長，其中以植物抗菌活性成分最受關注。Hu 等［48］從油茶餅粕中提取茶皂素，發現其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等細菌均具有良好的抑菌活性，MIC 值為31.3～62.5 μg/mL，而且茶皂素對革蘭氏陰性菌的抑制活性高于革蘭氏陰性菌，其認為原因可能是茶皂素與革蘭氏陰性菌的菌膜脂多糖結合，從而達到更好的抑制效果。此外，除了常見的細菌，茶皂素對魚類細菌也有顯著抗菌活性，Boran 等［49］研究發現，茶皂素作為膳食補充劑可抑制5 種虹鱒魚細菌病，提高魚存活率。進一步研究表明，茶皂素在體內體外的抗菌機理不同，其通過溶菌酶活性增強免疫功能以提高體內抗菌活性；而通過促進細菌裂解，抑制細菌粘附和增加細胞壁通透性以提高體外抗菌活性［48-49］。茶皂素是具有潛力的天然抗菌劑，為提高抗菌效果和安全性，需根據目標微生物確定對應的茶皂素單體，這仍需作進一步深入研究。

茶皂素具有廣譜和高抗真菌活性。近年來，關于茶皂素對植物致死型真菌報道逐漸增多，黃繼光等［50］測定12 種植物病原菌抑菌活性發現，茶皂素對稻瘟病菌、柑橘青霉病菌、番茄小核病菌、荔枝霜疫霉、玉米小斑病菌5 種病原菌菌絲生長有顯著抑制作用，其中稻瘟病菌和柑橘青霉病菌的EC50值為20.15、11.39 μg/mL。此外，茶皂素還具有良好的人工殺菌劑增效作用，其與代森錳鋅作用于辣椒炭疽病菌［51］，與甲霜靈混配作用于黃瓜疫病菌［52］的試驗結果均證實其增效作用，另有研究發現聯合用藥時MIC 為單獨用藥的1/4～1/32，可大幅度降低抗菌藥物使用量。由此可見，充分利用茶皂素的抗菌活性，研發綠色環保抗菌劑或實行聯合用藥對化學農藥減量化和綠色除菌具有重大意義。

4.2 溶血活性和毒性

茶皂素具有溶血活性，富含茶皂素的油茶粕可用于生產動物飼料，為減少過量茶皂素等抗營養因子的不良作用，脫毒成為必要步驟。Qian 等［53］研究發現，固態發酵可降低溶血活性，進一步研究表明，茶皂素溶血作用與苷元類型和糖側鏈有關，通常情況下糖鏈越長、毒性越大［54］。茶皂素具有魚毒作用，這種作用主要是因為茶皂素通過破壞魚鰓的上皮細胞進入鰓血管和心臟，使紅細胞產生溶血；也可能是由于魚蝦攜氧載體的差異［55］。陸劍鋒等［56］發現茶皂素制劑濃度為2.5 mg/L 時，24 h 內即可將實驗魚全部殺死；但即使茶皂素濃度高達50 mg/L 時，南美白對蝦、河蟹48 h 的存活率分別可達100%和90%以上。因此，茶皂素可作為清塘劑應用于水產品養殖，實現“清魚護蝦”的目的。

4.3 促進植物吸收污染物

近年來，土壤污染日益嚴重，利用植物修復的新型修復方法因成本低廉，較傳統修復便宜2～10 倍而快速發展，但修復效率低卻阻礙其大規模使用。研究表明，茶皂素可去除污染物也可促進植物吸收污染物。多環芳烴和重金屬是最主要的土壤污染源，Song 等［57］發現茶皂素對重金屬和多環芳烴具有良好去除作用，對污染土壤中菲和鎘去除率分別為87.7%和76.2%。在土壤中添加0.01%茶皂素后，玉米幼苗根中多氯聯苯（PCB14、18、77 和156）濃度是未經處理的2～3倍［58］。因此，利用茶皂素聯合凈化是一種極具前景的修復污染土壤的技術。

4.4 其他生物活性

茶皂素還具有胃腸保護、抗癌、降脂減肥等生物活性。近年來，眾多學者發現茶皂素可通過抑制胃粘膜損傷和抑制胃排空并加速胃腸道蠕動的方式保護腸胃。研究發現，多種茶皂素對乙醇或吲哚美辛誘導的胃粘膜損傷具有保護作用，在5.0 mg/kg 劑量下對胃粘膜損傷具有抑制作用，其中茶皂素E1 和E2 的抑制率為71.45%和77.6%，這種抑制效果強于臨床藥物奧美拉唑和鹽酸西曲辛［59］。此外，茶皂素還有良好的抗癌活性，其抗癌途徑主要包括誘導細胞凋亡和細胞周期停滯、抗血管生成和抑制奎寧氧化還原酶（QR）。Chen 等［4］發現油茶茶皂素對人乳腺癌細胞MCF-7 的細胞有顯著抑制效果，當濃度為30 μmol/L 時，抑制率超過80%。因此，充分利用茶皂素抗癌生物活性開發新型抗腫瘤藥物顯得十分重要。茶皂素能改善血液流變異常，調節血脂代謝，是良好的降血脂潛在藥物。Ye 等［60］研究表明，口服油茶皂素（50、100 mg/kg BW）可以降低總膽固醇、總甘油三酸酯和低密度脂蛋白水平，增加高密度脂蛋白含量，且有效性與陽性藥物辛伐他汀（4 mg/kg BW）相似。可見，茶皂素良好的生物活性物質對醫藥、食品以及化工領域都有積極作用。

5 展望

近年來，關于茶皂素的研究越來越多，且越來越深入。茶皂素提取和分離純化方法很多，各有其優勢，也有其局限性。傳統提取技術成本低，而新興提取技術效率高且產品純度高，但因成本過大而無法應用于工業大生產。因此，聯合使用傳統與新興提取純化方法提高純度和降低成本成為新的研究方向。

茶皂素具有抗菌、可調節胃腸系統、抗癌、降血脂等多種生物活性，基于其良好的抗菌活性，可研發綠色環保抗菌劑，實現綠色除菌的目的；基于其促進植物吸收污染物的活性，可作為土壤凈化劑，修復土壤污染；基于其腸胃保護、抗癌、降血脂和減肥等活性，可研制安全高效的合成替代藥物，為人類疾病預防和治療帶來新希望。盡管茶皂素是一種極具潛力的天然藥物，但目前研究尚停留在動物實驗階段且對其準確抗病機理仍不清楚，這也將是今后研究的重點。此外，茶皂素研究僅在少部分茶樹種類中開展，未來需要更加關注到未開發或者較少研究的茶樹種類中茶皂素的生物活性、構效關系和作用機理的研究。