PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗內源激素對NO的響應

張小芳，魏小紅*，劉放，朱雪妹

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界范圍內廣泛種植的牧草，其營養價值高，富含各種維生素和礦物質，纖維素和粗蛋白含量較高，且其粗壯的根系能夠改善土壤結構并增強土壤肥力，素有“牧草之王”的美稱［1-3］。但長期以來，干旱一直是限制西北地區紫花苜蓿產業化發展的重要因素，因氣候變化和降水量的減少，紫花苜蓿的生產受到制約，直接影響了畜牧養殖業的規模化發展。因此，深入研究紫花苜蓿抗旱的分子機制，提高苜蓿的產量和質量，對于推動西北地區畜牧業經濟發展具有極其重要的意義［4］。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種多功能的氣態自由基，可以輕易地透過細胞膜，作為信號物質參與細胞的生理生化過程并調控植物的生長發育。通常植物體內NO合成主要來源于一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）途徑［5］。研究表明，NO可通過調控碳水化合物代謝來緩解干旱脅迫對紫花苜蓿造成的損傷［6］。同時，NO介導的Ca2+信號可增強紫花苜蓿種子萌發和幼苗生長過程中的抗氧化酶活性來提高抗旱性［7］。NO能夠與其他內源激素互作調控植物生長發育［8］，如生長素（indole-3-acetic acid，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellin，GA3）和水楊酸（salicylic acid，SA），都是植物體內主要的激素，在逆境脅迫中扮演著很重要的角色［9］。作為干旱脅迫反應的應激激素，ABA與茉莉酸（jasmonic acid，JA）和NO相互作用，以促進氣孔閉合；同時，方華等［10］研究表明，ABA在提高月季（Rosa hybrida）的抗氧化酶活性過程中需要NO的參與。IAA和NO都可以促進植物根系的發育，且有研究發現NO作為信號分子在IAA的下游發揮重要作用［11］。單長卷等［12］研究發現，外施SA處理可以增加PEG脅迫下玉米（Zea mays）幼苗根系中NO的含量，但是清除根系中的NO會加劇干旱脅迫，表明干旱脅迫下在水楊酸的信號轉導過程中，NO可能發揮著重要的作用。

盡管NO在紫花苜蓿抗旱性方面已經有一些研究，但是NO對PEG脅迫下紫花苜蓿中4種內源激素的研究還未見報道，因此，本試驗以紫花苜蓿為材料，通過外源噴施一氧化氮釋放劑硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）和清除劑（carboxy-PTIO，cPTIO），采用液相色譜/質譜聯用（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）的方法分析4種內源激素，研究PEG脅迫下紫花苜蓿葉片和根系中內源激素對NO的響應，進一步了解NO與激素互作調控紫花苜蓿抗旱性的作用機制，為紫花苜蓿在西北干旱地區的推廣種植提供理論指導和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2019年3-6月在甘肅農業大學生命科學技術學院植物生理實驗室進行。供試紫花苜蓿品種為“三得利”（Medicago sativa“Sandili”），購買于甘肅省農業科學院種子公司。

選取籽粒飽滿且無病蟲害的紫花苜蓿種子，經0.1% HgCl2消毒5 min后，用去離子水沖洗5～6次，然后用蒸餾水浸泡24 h。選取露白一致的種子，均勻點播于裝有高壓滅菌營養土的花盆（直徑11 cm，高10 cm）中，每盆50粒，再覆蓋0.5 cm的土，輕輕壓實，花盆表面噴灑少量蒸餾水，在（25±1）℃下，14 h光照/10 h黑暗，光照強度6000 lx進行培養，每隔2 d使用稱重法補充水分，培養50 d后每盆挑選長勢一致且發育狀況良好的紫花苜蓿幼苗進行處理，具體試驗設計為T1（CK，蒸餾水）、T2（10% PEG）、T3（0.1 mmol·L-1SNP+10% PEG）、和T4（200 μmol·L-1cPTIO+10% PEG）。分別量取5 mL蒸餾水、SNP溶液、cPTIO溶液（cPTIO處理液中加入附著劑tween20）噴施于葉面進行處理，每24 h噴施1次；土壤中干旱處理澆40 mL 10% PEG溶液進行處理，對照加等量蒸餾水，連續處理8 d。在脅迫后第2、4、6、8天時取紫花苜蓿幼苗葉片和根系測定內源NO和內源激素（ABA，IAA，SA，GA3）含量，重復3次。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 內源NO含量測定 采用分光光度法（由蘇州科銘生物公司提供的NO試劑盒）測定NO含量，標準曲線回歸方程：Y=0.016X-0.0103，R2=0.9986。

1.2.2 內源激素含量測定 稱取4種植物激素（ABA、IAA、GA3、SA）對照品（購自Sigma公司）各10 mg，通過色譜甲醇溶解于10 mL容量瓶，得到濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液，然后逐級進行稀釋，得到濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和500.0 ng·mL-1的混合標準溶液。

參照鐘冬蓮等［13］的方法進行樣品前處理，稍做修改。稱取1 g的樣品材料，加入液氮迅速研磨后，轉移到50 mL的離心管，加入10 mL冷卻的體積比為99∶1的甲醇-甲酸溶液，放置5 min后于4℃冰箱浸提24 h，離心10 min（10000 r·min-1）得上清液。吸取1 mL上清液，加入4 mL水，混勻振蕩，過HC-C18小柱（事先分別用6 mL甲醇活化和5 mL 80%甲醇平衡小柱），上柱后，用10%甲醇溶液淋洗C18小柱，甲醇-甲酸溶液洗脫，收集洗脫液，用氮吹儀吹干后，用甲醇-甲酸溶液定容至1 mL，通過0.22μm濾膜進行過濾后，上機待測。

液相色譜-質譜聯用儀（Agilent 1290-6460，美國安捷倫科技有限公司），分辨率可達0.4 amu（原子質量單位），掃描范圍5～3000 m·z-1，可對復雜基質中痕量目標化合物進行分離、測定。流動相：A溶液為甲醇，B溶液為0.1%的甲酸水溶液，流速300μL·min-1，柱溫35℃，進樣量5μL。液相洗脫條件見表1。

表1 植物激素的液相洗脫條件Table 1 Liquid phase elution conditions of plant hormones

質譜參數：在MRM模式下，用ESI負離子模式，毛細管電壓為4 kV，干燥器流量為11 L·min-1，干燥器溫度為350℃，物化壓力為15 psi（pounds per square inch，磅·平方英寸-1），質譜參數見表2。

表2 不同內源激素在MRM模式下的MS參數Table 2 MS parameters of different endogenous hormones in MRM mode

1.2.3 4種激素的標準曲線 以質量濃度為縱坐標（C），峰面積為橫坐標（X）制作標準曲線，得到4種內源激素含量的線性方程（表3）。

表3 植物激素的標準曲線Table 3 Standard curve for plant hormones

1.2.4 植物激素含量 參照鄧文紅等［14］的分析方法，按照下列公式計算：

式中：C為內標曲線上激素的濃度（ng·mL-1）；V為樣品的定容體積（mL）；W為樣品鮮質量（g）。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據整理和作圖，同時用SPSS 21.0軟件比較差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同處理下紫花苜蓿幼苗葉片和根中NO含量的變化

隨脅迫處理時間的延長，紫花苜蓿葉片中PEG處理的NO含量先升高后降低并在第6天達到最大值（圖1）；PEG+SNP處理的NO含量呈先升高后降低的變化趨勢，并在第6天達到最大值（P＜0.05），與PEG+cPTIO處理相比升高了2.87倍；PEG+cPTIO處理的NO含量在脅迫初期降低，脅迫后期差異不顯著（P＞0.05）。紫花苜蓿根中PEG處理的NO含量在整個脅迫時期呈先升高后降低的變化趨勢，并在第6天達到最大值，與其他時間呈顯著性差異（P＜0.05）；PEG+SNP處理的NO含量在整個時期逐漸增加；除第6天外，PEG+cPTIO處理的NO含量在整個時期也逐漸增加，在脅迫處理的第8天各處理間的NO含量無極顯著差異。

圖1 不同處理下紫花苜蓿幼苗葉片和根系中NO含量的變化Fig.1 Changes of NO content in leaf and root of alfalfa seedlings under different treatments不同小寫字母表示相同處理下不同處理天數間差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示相同處理天數下不同處理間差異極顯著（P＜0.01），下同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment days under the same treatment（P＜0.05），and different uppercase letters indicate extremely significant differences among different treatment in the same treatment days（P＜0.01），the same below.

2.2 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中ABA含量對NO的響應

隨脅迫處理時間的延長，苜蓿葉片中PEG處理的ABA含量逐漸升高（圖2），在脅迫處理的第8天，達到最大值（P＜0.05），與PEG處理相比，PEG+SNP處理的ABA含量升高了22.73%（P＜0.01），PEG+cPTIO降低了61.76%；在整個脅迫時期，PEG+SNP和PEG+cPTIO處理的變化趨勢一致，在脅迫的第8天達到最大值。紫花苜蓿根系中各處理的ABA含量顯著低于葉片，在整個脅迫時期，PEG處理在第8天時達到最大值，與其他時間呈顯著差異（P＜0.05）；PEG+SNP處理先降低后升高，在第2天達到最大值；PEG+cPTIO與PEG+SNP處理變化趨勢相反，在第8天時PEG+cPTIO處理降低到最小值，與PEG+SNP處理無極顯著差異。

2.3 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中IAA含量對NO的響應

紫花苜蓿葉片中各處理的IAA含量均呈先升高后降低再升高的變化趨勢（圖3），在脅迫處理的第8天，PEG處理的IAA含量達到最大值，與其他時間呈顯著差異（P＜0.05），與PEG+SNP和PEG+cPTIO處理相比，PEG處理的IAA含量升高了2.53和2.95倍（P＜0.01）；PEG+SNP處理的IAA含量在第4天達到最大值，與PEG+cPTIO處理的變化趨勢一致，且PEG+cPTIO比PEG+SNP處理的IAA含量降低了62.32%；紫花苜蓿根中PEG處理的IAA含量在第4天達到整個時期的最大值，并且根中PEG處理的IAA含量高于葉片中；PEG+SNP處理的IAA含量先降低后升高，而PEG+cPTIO處理的IAA含量先升高后降低，在脅迫的第8天，與PEG+SNP處理相比，PEG+cPTIO處理IAA含量降低了91.67%（P＜0.01）。

圖2 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中ABA含量對NO的響應Fig.2 Response of ABA content in leaf and root of alfalfa seedlings to NO under PEG stress

圖3 PEG脅迫下紫花苜蓿葉片和根中IAA含量對NO的響應Fig.3 Response of IAA content in leaf and root of alfalfa seedlings to NO under PEG stress

2.4 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中SA含量對NO的響應

隨脅迫時間的延長，苜蓿葉片中PEG處理的SA含量在脅迫后期逐漸減少（圖4）；PEG+SNP和PEG+cPTIO處理逐漸增加，除第2天外，PEG+cPTIO處理在整個脅迫時期都高于其他處理，在脅迫的第8天達到最大值（P＜0.05），且PEG+SNP處理比PEG+cPTIO降低25.96%。苜蓿根中PEG處理的SA含量逐漸增加，到第8天時開始降低；PEG+SNP和PEG+cPTIO處理的變化趨勢不同，在脅迫處理的第8天，PEG+SNP處理增加，而PEG+cPTIO處理降低，與PEG+SNP處理相比，PEG+cPTIO降低了88.69%（P＜0.01）。

2.5 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中GA3含量對NO的響應

隨脅迫處理時間的延長，PEG處理的GA3含量先降低后升高（圖5），在整個脅迫時期，除CK外，其他處理的苜蓿葉片均在第2天達到最大值，與PEG和PEG+cPTIO處理相比，PEG+SNP處理分別升高了50.33%和54.49%；在脅迫的第4天和第6天時，各處理間之間無極顯著差異，PEG+cPTIO處理逐漸降低。苜蓿根中PEG處理的GA3含量在第6天與其他處理呈極顯著差異（P＜0.01）；PEG+SNP處理的GA3含量在第2天達到最大值，脅迫后期下降后緩慢升高，但是差異不顯著（P＞0.05）；而PEG+cPTIO處理與PEG+SNP處理的變化趨勢相反，其GA3含量先升高后降低并在第4天達到最大值，與其他處理間呈極顯著差異（P＜0.01）。

圖4 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中SA含量對NO的響應Fig.4 Response of SA content in leaf and root of alfalfa seedlings to NO under PEG stress

圖5 PEG脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片和根中GA3含量對NO的響應Fig.5 Response of GA3 content in leaf and root of alfalfa seedlings to NO under PEG stress

3 討論

3.1 不同處理下紫花苜蓿幼苗葉片和根系中NO含量的變化

在植物生長過程中，干旱脅迫會對細胞質膜造成損傷，打破離子的動態平衡，從而影響植物體的生長和發育［15］。NO作為第二信使，在植物的生長發育和逆境脅迫中起到很重要的作用（圖6），本研究發現，PEG脅迫下，苜蓿葉片中NO含量先升高后降低，并在第6天達到最大值；外源噴施SNP能夠增加苜蓿葉片中NO含量，而噴施NO清除劑cPTIO能夠抑制NO含量的增加，已有研究表明，外源施加NO處理會促進干旱條件下小麥（Triticum aestivum）根系和地上部的生長［16］，同時，邵瑞鑫等［17］研究發現外源NO預處理后，玉米幼苗中的NO含量會增加，進而改善了玉米植株的生長。PEG脅迫下添加SNP處理時苜蓿根系的NO含量逐漸增加，可能是根系生物量和生理生化代謝等方面發生一系列變化，以適應干旱逆境，而NO可以通過調節植物根系離子吸收速率［18］和抗氧化酶活性等來增強植物對脅迫的響應。

3.2 PEG脅迫下NO對紫花苜蓿幼苗葉片和根系中ABA含量的影響

ABA是一種在植物逆境脅迫中變化最為明顯的激素，是評價植物抗旱性的重要指標［19］。NO可以與ABA互作共同參與植物的防御反應。本試驗研究發現，除對照外，PEG脅迫下苜蓿葉片中各處理ABA的含量整體呈上升的趨勢，并在第8天達到最大值，此時PEG+SNP處理的ABA含量明顯高于PEG+cPTIO處理，Ruan等［20］研究發現，鹽脅迫下，外源加施NO會促進小麥幼苗葉片中內源脫落酸的合成，并且NO和ABA信號分子在此誘導過程中不存在累積效應，同時，葉片中ABA含量的增加也可以達到促進氣孔關閉以增強植株抗旱能力的效 果［21］。與葉片相比，根 中PEG+SNP處理的ABA含量在脅迫期間先降低后升高，并在第2天達到最大值，Desikan等［22］推測，滲透脅迫下植物體內合成的NO可能會激活根細胞質膜相關的離子通道，促進K+快速積累，通過ABA調節植物根系細胞水勢，可以改善滲透脅迫下植物的適應性生長；PEG+cPTIO處理的ABA含量逐漸增加，到第8天含量降低，可能是因為根系合成的ABA轉運到植物葉片，促使葉片中PEG+cPTIO處理的ABA含量第8天達到最大值。

圖6 PEG脅迫下NO誘導紫花苜蓿葉片和根系內源激素的調控網絡Fig.6 NO-induced regulation network of endogenous hormones in leaf and root of alfalfa under PEG stress

3.3 PEG脅迫下NO對紫花苜蓿幼苗葉片和根中IAA含量的影響

植物根系發育過程中合成的IAA不是停留在固定部位，而是通過極性運輸到特定部位才能發揮作用［23-24］，其他植物激素多通過與IAA協同或拮抗的作用來共同調控根系發育［25］。沈宏偉等［26］研究發現外源SNP處理可以增加IAA含量從而促進種子萌發；在擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗形態改變的信號轉導過程中，NO與IAA在Cu2+脅迫下存在負調控關系［27］，此外，也有研究表明，在擬南芥中NO作為信號分子在生長素的下游起作用［28］，因此，NO與生長素在植物生長過程中的關系較為復雜。本試驗結果表明，除第6天外，PEG脅迫下苜蓿葉片的IAA含量增加，并在第8天達到最大值，閆志佩［29］觀察到干旱使小麥葉片的IAA氧化酶活力下降，進而IAA含量增加，本研究結論與其一致。苜蓿葉片中PEG+SNP和PEG+cPTIO處理的IAA含量快速上升，在第4天達到最大值，并且PEG+SNP處理的IAA含量顯著高于PEG+cPTIO處理，PEG脅迫下苜蓿葉片中IAA含量增加時，PEG+SNP處理的IAA含量相應的也會增加，表明NO可能作用于IAA信號通路的下游。

苜蓿根中PEG+SNP處理的IAA含量在脅迫前期下降，一方面是因為NO在生長素誘導根系生長過程中作為下游信號分子發揮作用［30］；另一方面是因為苜蓿根系中的IAA轉運到葉片中，從而使葉片中PEG+SNP處理的IAA含量在第4天達到最大值。脅迫后期PEG+SNP處理的IAA含量上升，與PEG+cPTIO處理的變化趨勢相反，Correa等［31］研究表明，在正常條件下，外源添加NO供體能促進番茄（Lycopersicon esculentum）側根原基的形成和側根的伸長，而外源添加NO清除劑cPTIO則能顯著抑制側根伸長，這與脅迫后期苜蓿根系添加SNP和cPTIO的研究結論一致，表明PEG脅迫下NO在植物根系中也可以起到相同的作用。

3.4 PEG脅迫下NO對紫花苜蓿幼苗葉片和根中SA含量的影響

SA是植物體內普遍存在的一種生長調節物質，在逆境脅迫響應等方面具有重要作用［32-36］，研究發現，植物體內的SA可通過增強植物抗氧化系統活性來增強植物的抗旱性［37］。施加外源SA可拮抗干旱對小麥根鮮重及根中可溶性糖的影響，來增強小麥的抗旱性［38-39］。本試驗研究表明，PEG脅迫下苜蓿葉片中外源SNP處理的SA含量逐漸增加，并在第8天達到最大值，研究發現，外源添加NO會使煙草（Nicotiana tabacum）葉片中的內源SA含量增加［40］，并且SA誘導擬南芥中NO合成的過程中，在一定范圍和時間內NO合成量隨SA濃度升高而增加［41］，表明SA與NO的信號應答途徑并非孤立，二者在抗旱反應中存在交互作用［42］，本研究結論與其一致。PEG+cPTIO處理的SA含量在脅迫期間逐漸增加并高于其他處理，一方面是因為PEG脅迫下清除植物體內NO含量會促使苜蓿受到雙重脅迫，而SA含量的增加可以緩解干旱脅迫的損傷，這是一種應激反應的體現；另一方面，劉新等［43］推測NO的減少在短時間內刺激了NOS產生更多NO，促進氣孔關閉，增強了葉片的抗旱能力。與葉片相比，苜蓿根系中PEG+SNP處理的SA含量先降低后升高，在第8天達到整個脅迫時期的最大值；而PEG+cPTIO處理SA含量總體呈下降趨勢，在第8天達到最小值，可能的原因是根中SA轉運到葉片使得葉片中PEG+cPTIO處理的SA含量達到最大值。

3.5 PEG脅迫下NO對紫花苜蓿幼苗葉片和根中GA3含量的影響

GA3是一種雙萜類化合物激素，能促進細胞分裂和伸長。已有研究表明干旱脅迫會影響水稻（Oryza sativa）根中與赤霉素代謝相關基因的表達［44］。本研究結果顯示，PEG脅迫下苜蓿葉片GA3含量先下降后緩慢上升，這可能與GA3在植物逆境脅迫下扮演著減緩生長的負調控信號有關［45］。葉片和根系中PEG+SNP處理的GA3含量（除第8天外）在整個脅迫時期先下降后緩慢上升，表明葉片和根系中外源添加SNP對GA3含量的增加有抑制作用，Beligni等［46］研究表明，NO可作為一種抗氧化劑減緩大麥（Hordeum vulgare）糊粉層的細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），本研究結論與其一致。苜蓿根系中PEG+cPTIO處理的GA3在第4天達到最大值，可能的原因是根尖合成的GA3在外源添加cPTIO后，阻止GA3向葉片中運輸，從而積累到根系中，所以第4天根系中GA3含量達到最大值，葉片中GA3含量降低。并且根系中GA3含量的最大值大于葉片中，表明根系中合成的GA3較多。

4 結論

PEG脅迫下加施外源NO能促進紫花苜蓿葉片和根系中NO含量的增加，其清除劑明顯降低了紫花苜蓿葉片中的NO含量；隨著脅迫處理時間的延長，葉片和根中的ABA和SA含量逐漸增加，但根系中ABA和SA含量的增加晚于葉片；NO會在短期內誘導葉片和根系中IAA和GA3含量增加。綜上所述，NO可通過誘導紫花苜蓿IAA、ABA、GA3和SA 4種激素的代謝水平及根中的相互轉化調控植物的生長與抗逆，尤其是ABA和SA的調節最為明顯。