飼養水平對阿勒泰羊胃腸道發育、瘤胃發酵參數及瘤胃微生物區系的影響

李宏，宋淑珍，高良霜，郎俠，劉立山，宮旭胤，魏玉兵，吳建平，3**

（1.甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所，甘肅省牛羊種質與秸稈飼料化重點實驗室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州730070；3.西北師范大學新農村發展研究院，甘肅 蘭州730070；4.平山湖蒙古族鄉畜牧獸醫站，甘肅張掖734000）

反芻動物與單胃動物相比有著特殊的消化器官瘤胃，瘤胃是反芻動物發酵、消化和代謝的重要場所，飼料中約有70%～85%可消化物質和50%粗纖維在瘤胃內消化，瘤胃對反芻動物營養物質消化和吸收起著至關重要的作用［1］。而瘤胃微生物是瘤胃發酵必不可缺少的物質［2］，對反芻動物的營養生理起著至關重要的作用，微生物區系非常復雜，隨飼料種類、營養水平、飼養環境、動物品種和年齡等的不同而發生變化［3-4］，瘤胃微生物包括細菌、原蟲和真菌，以厭氧性纖毛蟲和細菌為主。瘤胃中的揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）、菌體蛋白由瘤胃微生物厭氧發酵而產生，VFA為反芻動物提供70%～80%的能量，這將直接影響動物的生產性能［5-7］。纖維素酶等消化酶由瘤胃細菌所分泌［8］，消化酶的活性受飼糧和腸道內環境因素所調控［9］。動物對飼糧營養物質的消化吸收主要依賴于瘤胃中瘤胃微生物和各種消化酶，所以瘤胃發酵和瘤胃微生物對飼糧的利用率及營養物質的消化吸收有著巨大的影響［10］。阿勒泰羊主要分布在新疆北部的阿勒泰地區福海縣、富蘊縣、清河縣等地，因其尾臀合一碩大，又被稱為大尾羊或阿勒泰大尾羊［11］，為肉脂兼用型綿羊品種。該羊耐粗飼、抗逆性強，以其體型大、肉脂生產性能高而聞名［12-13］。阿勒泰羊在原產地終年放牧［14］，由于生態環境保護，牧場資源限制，傳統的放牧飼養已不適合現代畜牧業的發展要求，如何有效利用飼糧的營養水平改善瘤胃內環境，調控瘤胃微生物數量，進而調節動物的生產性能及降低養殖成本，促進反芻動物對營養物質的利用和吸收，是反芻動物營養研究的一個重要方向，且飼糧的營養水平對阿勒泰羊胃腸道發育、瘤胃發酵及瘤胃微生物區系的影響鮮有報道，為此本試驗旨在探討短期不同飼養水平對肥臀羊阿勒泰羊胃腸道發育、瘤胃內環境、消化酶活性及瘤胃微生物區系的影響，為通過營養水平調控阿勒泰羊生產提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取月齡相近（3～3.5月齡）、體重接近（19.16±0.54 kg）、臀型一致、健康狀況良好的阿勒泰羔羊30只，隨機分為3組，每組10只羊，單欄飼養，自由采食60 d，參照NRC（2007）飼養標準中維持能量（energy for maintenance，Em）需要，3個組分別按1.5（0.75 MJ·kg-1W0.75，1.5Em組）、1.0（0.50 MJ·kg-1W0.75，1.0Em組）和0.5倍Em（0.25 MJ·kg-1W0.75，0.5Em組）飼喂30 d。試驗羊每隔10 d稱重，調整飼喂量。試驗結束后每組選取9只羊按畜類屠宰加工通用技術條件（GB/T 17237-2008）的要求屠宰，并按采樣要求收集樣品。

1.2 飼養與管理

試驗始于2018年7月30日止于2018年11月6日，在甘肅省張掖市平山湖鄉種羊場進行，預試期10 d，正試期90 d。試驗前一周，打掃清理羊舍，并對羊舍、羊欄、食槽等進行消毒。試驗開始前，試驗羊逐個稱重、打耳標和驅蟲（驅蟲后48 h內徹底打掃羊舍）。每組10只，單欄飼養，羊欄長3.0 m，寬2.0 m，配置飲水和采食一體的食槽，每天早上8：00、下午5：00分兩次飼喂，自由飲水。試驗羊舍為彩鋼半開放式羊舍，溫度、光照、通風等飼養環境條件一致。試驗飼糧根據美國NRC（2007）肉用綿羊的需要標準配制，試驗期綿羊飼糧的組成、基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 飼糧組成及營養水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（Air-dry basis）

1.3 樣品采集

試驗結束后，禁食、自由飲水12 h后將試驗羊屠宰，屠宰后迅速分離出瘤胃，采集瘤胃內容物及瘤胃液、瘤胃液經4層紗布過濾后，裝于滅菌的凍存管-20℃內保存，用于測定瘤胃發酵參數及消化酶活性；瘤胃內容物置于滅菌的凍存管內-80℃凍存，用于瘤胃微生物區系的測定。同時，取出胃腸道測定重量及小腸長度。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 胃腸道發育 試驗羊屠宰后迅速將瘤胃、網胃、瓣胃和皺胃內容物清理干凈，然后稱總重，之后將瘤胃結扎分離出來進行稱重。將小腸分離后清理內容物進行稱重，之后將小腸展開用皮尺測量長度，最后計算瘤胃指數和小腸指數。

1.4.2 瘤胃液pH、氨態氮（NH3-N）、揮發性脂肪酸（VFA） 用便攜式酸度計直接測定瘤胃液pH，參照馮宗慈等［16］的方法改進后測定瘤胃液NH3-N含量；利用日本島津（GC-2010 plus）氣相色譜儀測定VFA，采用內標法，內標為2-乙基丁酸（2EB），色譜柱：AT-FFAP（50 m×0.32 mm×0.25μm）毛細管柱。色譜柱程序升溫：溫度60℃保持1 min，以5℃·min-1升至115℃，不保留，再以15℃·min-1升至180℃，檢測器溫度260℃，進樣口溫度250℃。

1.4.3 消化酶活性 瘤胃液中淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶活性的測定，采用南京建成生物工程研究所試劑盒［淀粉酶（C016-1-1）、脂肪酶（A054-2-1）、胃蛋白酶（A080-1-1）］，測定步驟按照試劑盒說明書方法進行，用北京六一生物科技有限公司全自動酶標儀（WD-2102B）測定。

1.4.4 瘤胃微生物區系 瘤胃微生物總DNA利用天根糞便基因組DNA提取試劑盒（DP-328）提取。提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性和純度，用超微量分光光度計（Therm Nano Drop-2000）檢測OD260/280。微生物特異性引物序列見表2，所有引物均由上海生物工程有限公司合成。利用ABI QuantStudio-5熒光定量基因擴增儀熒光定量PCR（RT-qPCR）比較閾值法測定微生物相對含量。PCR反應體系及反應參數參照天根SuperReal熒光定量預混試劑增強版（SYBR Green-FP205）說明書進行。反應體系20μL，2×SuperReal PreMix Plus 10μL，上下游引物各0.6μL，模板1μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，ddH2O 7.4μL。反應參數為95℃預變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火32 s，共計40個循環。

表2 瘤胃微生物引物序列Table 2 The primer sequence of rumen microorganisms

1.5 數據統計分析

采用2-ΔΔct法［20］計算目的菌相對含量，以總細菌為內參基因。用Excel 2010整理數據，然后采用SPSS 21.0統計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan法進行多重比較，結果用平均值±標準差表示，顯著性差異判斷標準為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 飼養水平對綿羊胃腸道發育的影響

隨飼養水平的降低，全胃、瘤胃、小腸重逐漸降低，1.5Em組的全胃重、瘤胃重顯著高于1.0Em和0.5Em組（P＜0.05）。1.5Em組的全胃重分別比1.0Em、0.5Em組高37.74%、55.32%，瘤胃重分別比1.0Em、0.5Em組高39.02%、50.00%。3組間的小腸重量差異顯著（P＜0.05），1.5Em組分別比1.0Em和0.5Em組高10.91%、41.86%（表3）。1.5Em組瘤胃占宰前活重比例顯著高于其他兩組（P＜0.05），分別高于1.0Em、0.5Em組44.17%、38.40%。0.5Em組的小腸占宰前活重比例及小腸長度顯著低于其他兩組（P＜0.05）。

表3 飼養水平對綿羊胃腸道發育的影響Table 3 Effect of feeding level on the development of the gastrointestinal tract in sheep

2.2 飼養水平對綿羊瘤胃發酵參數的影響

隨飼養水平的降低，綿羊瘤胃液pH先升高后降低，且1.5Em組顯著低于1.0Em和0.5Em組（P＜0.05），分別降低了8.48%、6.69%（表4）。NH3-N含量隨飼養水平的降低逐漸降低，但3組間差異不顯著（P＞0.05）。1.0Em組的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總酸及乙酸/丙酸均最低，且1.0Em組的丙酸含量與其他2組相比差異顯著（P＜0.05），分別低于1.5Em、0.5Em組24.49%、24.70%。

表4 飼養水平對綿羊瘤胃發酵參數的影響Table 4 Effect of feeding level on rumen fermentation in sheep

2.3 飼養水平對綿羊瘤胃消化酶活性的影響

隨飼養水平的降低，α-淀粉酶活性先降低后升高并且3組之間的差異顯著（P＜0.05），1.5Em組分別比1.0Em、0.5Em組高102.07%、53.35%（表5）。脂肪酶活性和胃蛋白酶活性均隨飼養水平的降低而逐漸降低，且1.5Em組顯著高于其他兩組（P＜0.05），1.5Em組脂肪酶分別比1.0Em、0.5Em組高76.45%、108.36%；胃蛋白酶分別比1.0Em、0.5Em組高63.20%、122.74%。

表5 飼養水平對綿羊瘤胃消化酶活性的影響Table 5 Effect of feeding level on the activity of the digestive enzymes in the rumen

2.4 飼養水平對綿羊瘤胃微生物區系的影響

飼養水平對阿勒泰羊瘤胃微生物區系具有顯著影響（表6），瘤胃內容物中真菌、原蟲的相對含量1.5Em組顯著高于1.0Em和0.5Em組（P＜0.05），1.0Em和0.5Em組之間差異不顯著（P＞0.05）。1.5Em組的真菌相對含量分別比1.0Em、0.5Em組高197.0%、228.9%，原蟲相對含量分別比1.0Em、0.5Em組高392.5%、212.7%。1.5Em組的產琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌的相對含量與1.0Em組相比差異顯著（P＜0.05），但與0.5Em組相比差異不顯著（P＞0.05），3組間的黃色瘤胃球菌相對含量差異均不顯著（P＞0.05）。

表6 飼養水平對阿勒泰羊瘤胃微生物區系的影響Table 6 Effect of feeding level on rumen microbial flora in Altay sheep

3 討論

3.1 飼養水平對綿羊胃腸道發育的影響

反芻動物的胃腸道發育程度對動物的生產性能具有決定性作用［21］，胃腸道的發育受遺傳因素和環境因素的影響，相對而言環境作為后天調控胃腸道發育的主要因素，更易于調控。瘤胃和小腸是反芻動物消化系統中最重要的器官，飼糧進入瘤胃經過充分的發酵，微生物消化后，送入小腸進行吸收，發育良好的胃腸道對促進飼糧消化吸收、提高飼糧轉化利用和充分發揮動物生產潛力具有重要的意義［22］。田豐等［23］報道，飼糧的營養水平顯著影響巴美肉羊的胃腸道和內臟器官發育，高營養水平顯著提高了巴美肉羊的瘤胃及小腸重。祁敏麗等［24］的研究表明，隨飼糧營養水平的降低，湖羊羔羊的內臟器官、胃腸道發育質量及占宰前活重指數均顯著降低，且顯著抑制了瘤胃的發育。呂小康［25］以不同營養水平的飼糧飼喂海門山羊羔羊，結果發現隨飼糧營養水平的升高，山羊羔羊瘤胃重及瘤胃占復胃及宰前活重的比例均隨飼糧營養水平的升高而逐漸升高。本試驗中隨飼養水平的降低，阿勒泰羊胃腸道重及其占宰前活重的比例均降低，這與前人的研究結果一致，這說明飼養水平顯著影響阿勒泰羔羊胃腸道發育。這可能是高飼養水平下動物所攝取的飼糧營養水平較高，進入消化道后促進了瘤胃及小腸肌肉的發育而使得其重量增大［26］，也可能是在高飼養水平下飼糧的消化與代謝產生的刺激使消化道的重量增加并促進消化道肌肉的發育［27］。

3.2 飼養水平對綿羊瘤胃發酵參數的影響

瘤胃是反芻動物獨有的消化器官，穩定的瘤胃內環境對反芻動物至關重要。pH、氨態氮（NH3-N）、揮發性脂肪酸（VFA）是評價瘤胃內環境的主要指標，也反映了瘤胃的健康水平與發酵狀況［28］。pH是直觀反映瘤胃發酵情況的重要參數指標，瘤胃正常發酵的pH范圍為5.5～7.5［29］。本試驗中瘤胃pH為6.69～7.31，均在正常范圍內，其規律為隨飼養水平的下降pH先升高后降低，說明飼養水平顯著影響瘤胃發酵情況，這與白大洋［30］在西門塔爾牛上的研究結果一致。這可能是因為隨飼糧營養水平的提高，瘤胃中乙酸、丙酸比例升高進而導致瘤胃pH下降。瘤胃中NH3-N主要來源于飼糧中的蛋白質、非蛋白氮、微生物蛋白以及尿素循環，其濃度高低主要反映瘤胃中微生物氮的供應狀況［31］。過高和過低的NH3-N濃度，都不利于瘤胃微生物的生長，過高造成氮浪費，甚至引起動物氨中毒，過低會阻礙瘤胃微生物分解纖維素的效率［32］，動物生產性能降低。Thao等［33］研究表明，促進微生物繁殖生長的NH3-N適宜濃度為5～30 mg·dL-1，本試驗中瘤胃NH3-N含量為5.88～7.61 mg·dL-1，均在正常范圍內，適于瘤胃微生物的生長。反芻動物70%～80%能量由瘤胃中的VFA提供［34］，而乙酸、丙酸、丁酸是最主要的VFA，占VFA的95%左右，當瘤胃液pH≥7時，瘤胃上皮對VFA的吸收快慢依次為乙酸、丙酸、丁酸，反之則相反［1］，這也可能是1.0Em、0.5Em組瘤胃液乙酸、丁酸含量顯著低于1.5Em組的原因之一。而1.0Em組的VFA含量最低，可能是在1.0Em飼養水平下瘤胃上皮對其吸收效率最佳。王堯悅［35］報道，飼糧的營養水平顯著影響VFA的含量。王桂超等［36］在對蒙古羔羊進行營養限制后瘤胃中的VFA、異丁酸、丁酸、戊酸含量也顯著降低。夏傳齊［37］的研究也表明，高營養水平飼糧顯著提高荷斯坦奶公牛瘤胃液VFA、乙酸、丙酸、丁酸含量，本試驗結果與上述報道相一致，這表明營養水平對反芻動物瘤胃發酵具有調控作用，顯著影響瘤胃發酵。

3.3 飼養水平對綿羊瘤胃消化酶活性的影響

動物品種、年齡、飼糧營養水平、消化道部位、外源酶制劑以及神經和體液［38］是影響消化酶活性的重要因素，家畜對所攝入的營養物質的消化程度與消化酶活性直接相關［39］，動物的生長發育和生產與攝入的營養水平密切相關，而動物胃腸道所產生的消化酶活性及其分泌量與動物對營養物質消化吸收程度呈正相關［40］。陳軍強等［41］報道，對小尾寒羊進行營養限飼后，瘤胃中纖維素酶的活性越低，并且限飼程度愈高，纖維素酶的活性降低程度越大。景小平等［42］對冷季補飼藏羊進行研究表明，藏羊冷季補飼量越大，瘤胃及小腸的消化酶活性越強，從而提高了藏羊的生長性能。本試驗中除動物所攝入的營養水平不同外，其他因素均相同，其結果表明，試驗羊隨采食量水平的降低，瘤胃酶活性逐漸降低，也進一步說明采食量水平與消化酶活性顯著相關。

3.4 飼養水平對綿羊瘤胃微生物區系的影響

反芻動物出生后，隨著與母畜及周圍環境接觸，逐漸建立瘤胃微生物區系并不斷完善，瘤胃中微生物主要有細菌、真菌和原蟲，瘤胃微生物結構和組成對于維持瘤胃內環境穩態、促進飼料消化吸收和動物的健康具有重要的作用［43］，因此，調控瘤胃微生物區系在反芻動物營養研究中占有舉足輕重的作用。瘤胃微生物區系的組成受諸多因素的影響，其中飼糧是最重要的因素。產琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌是主要的纖維降解菌［44］，針對瘤胃中主要的纖維降解菌，前人研究結果并不一致。王堯悅等［45］研究報道，隨飼糧營養水平的提高，灘羊瘤胃中黃色瘤胃球菌的數量均顯著升高。王斌星等［46］報道，隨飼糧能量水平的提高，育肥牦牛黃色瘤胃球菌的數量有降低的趨勢，但對產琥珀酸絲狀桿菌和白色瘤胃球菌無顯著影響。而另一方面，瘤胃原蟲含量在營養調控方面具有極大的負面效應，原蟲會阻礙纖維物質的利用率，也會大大降低瘤胃中整個微生物蛋白質的有效合成［47］。有研究結果表明，飼糧中添加大蒜油和植物提取物可顯著降低瘤胃原蟲含量［48-49］，顯著提高反芻動物對飼糧的利用率［50］。本試驗結果發現，隨營養水平的降低，真菌、原蟲相對含量顯著降低。黃色瘤胃球菌的相對含量3組之間無顯著差異，但1.0Em組相對含量最高，且原蟲含量最低，這表明1.0Em飼養水平可使動物對營養物質的利用效率達到最佳。本試驗是以控制飼糧采食量水平為基礎，而使動物所攝入的營養水平不同對瘤胃微生物區系進行調控，3組之間的瘤胃微生物相對含量各不同的原因可能是，在本試驗條件下3組試驗羊所攝入的營養水平不同，進而影響了瘤胃微生物區系。

4 結論

在本試驗條件下，綿羊瘤胃發酵參數中的pH先升高后降低、NH3-N含量逐漸降低，在1.0Em飼養水平下瘤胃對VFA的吸收最佳，真菌、原蟲的相對含量顯著降低有效改善了瘤胃微生物區系。