螺旋藻多糖對急性T淋巴細胞白血病細胞的殺傷作用

李巖，張競男，張謹，石文華，葉書梅，鄧秀玲，扈瑞平，薛慧婷

白血病是一類惡性血液病，其中急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是成年人群中最常見的急性白血病，其患病率為3/10萬～5/10萬［1］。目前治療AML的手段主要有干細胞移植和化療，但治療費用昂貴且存在嚴重的不良反應，治療后患者的5 年生存率低于 50%［2?3］。因此，尋找高效、低毒、經濟的靶向藥物已成為目前的研究熱點之一。螺旋藻屬于藍藻門、藍藻綱、顫藻目、顫藻科，是一種絲狀多細胞螺旋形原核藻類生物，含有豐富的蛋白質、多糖、脂肪、維生素、礦物質、葉綠素、β?胡蘿卜素等［4］。螺旋藻多糖（spirulina platensis polysaccharides，SPP）作為螺旋藻重要的生物活性物質之一，具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、提高機體免疫力等多種功效［5?7］。曾波航等［8?9］研究發現，鈍頂螺旋藻多糖能夠提高白血病患者自然殺傷（NK）細胞的活性，但不影響正常人NK細胞的活性；同時發現鈍頂螺旋藻多糖能夠增強白血病患者淋巴因子激活的殺傷（LAK）細胞的活性，進而減少白細胞介素（interleukin，IL）?2的用量。曲顯俊等［10］研究發現 SPP 對白血病細胞 K562 具有殺傷作用。Flores Hernandez 等［11］亦發現螺旋藻提取物對急性粒細胞白血病Kasumin?1細胞和慢性髓細胞性白血病K562 細胞具有殺傷作用。然而，SPP對白血病細胞殺傷作用的機制尚未明確，且相關研究罕見。本研究旨在探討SPP對人急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat的殺傷作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種與細胞系 藻種：鄂爾多斯鈍頂螺旋藻藻粉，購自內蒙古蒙加力螺旋藻業有限責任公司。細胞系：人急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat 細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 試劑與儀器 MTT、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司，RPMI 1640 培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，雙抗（青霉素/鏈霉素）購自碧云天生物技術有限公司，PVDF 膜購自Roche 公司，牛血清白蛋白（BSA）購自 Sigma 公司，caspase?3 抗體、CD45 抗體、CD71 抗體、Phospho?p44/p42 MAPK（p?ERK）抗體、MAPK（Thr202/Tyr204，t?ERK）抗體、Phospho?SAPK/JNK（p?JNK）抗體以及SAPK（Thr183/Tyr185，t?JNK）抗體、β?actin抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗和HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗均購自Cell Signaling Technology，其他試劑均為國產分析純。EPOCH 酶標儀購自北京伯騰儀器有限公司，BG?verMINI 垂直電泳儀購自北京百晶生物技術公司，IC1000細胞計數儀購自上海睿鈺生物科技有限公司，CCL?170B?8 二氧化碳培養箱與 ACB?4E1?CN 超凈工作臺均購自美國ESCO 公司，SX?500 全自動高壓滅菌鍋購自TOMY 公司，FD?1A?50+冷凍干燥劑購自北京博醫康實驗儀器有限公司，5418R高速冷凍離心機購自美國Eppendorf公司，GelView 6000 plus智能圖像工作站購自廣州博鷺騰生物科技有限公司，Revolve FL 正置倒置一體熒光顯微鏡購自美國Echo Laboratories。

1.2 方法

1.2.1 SPP制備 SPP的制備方法參照杜玲［12］研究。取500 g螺旋藻藻粉，反復凍融法破壁，乙醇脫脂后，按照1∶20料液比于80 ℃條件下煮提8 h。利用旋轉蒸發儀濃縮多糖提取液，經三氯乙酸除蛋白,無水乙醇沉淀后，減壓凍干得到SPP。

1.2.2 細胞培養與分組 利用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基（含有10%青霉素/鏈霉素雙抗）復蘇Jurkat細胞，置于37 ℃5%CO2細胞培養箱中培養，待細胞傳至2代以上，取對數生長期細胞進行實驗。實驗設對照組和1 g/L、2 g/L、5 g/L SPP 組，對照組不進行SPP處理，SPP組分別加入1 g/L、2 g/L和5 g/L SPP溶液進行處理。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖情況 取對數生長期Jurkat 細胞，以5×105個/mL的密度接種于96孔板中，每孔加入500 μL細胞，37 ℃5%CO2細胞培養箱中孵育48 h。然后每孔加入20 μL MTT（5 g/L），繼續孵育 4 h。最后每孔加入 100 μL 20%SDS溶解甲臜過夜，利用酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率（%）=（A對照組?A實驗組）/A對照組×100%。

1.2.4 Western blot 法檢測 caspase?3 蛋白及 MAPK 信號通路相關蛋白的表達 取對數生長期Jurkat 細胞，以2×105個/mL的密度接種于12孔板中，每孔加入500 μL細胞，以及500 μL不同劑量的SPP 溶液（1、2 和5 g/L），對照組加入相同體積的RPMI 1640 培養基，于37 ℃5%CO2恒溫培養箱中孵育48 h后，以1 500×g離心5 min，得到每組細胞沉淀，利用細胞裂解液裂解細胞，通過Bradford 法進行蛋白定量。取10 μg 蛋白進行SDS?PAGE，通過濕轉法進行轉膜，脫脂奶粉封閉，準備進行一抗和二抗孵育。將封閉后的PVDF 膜經caspase?3、CD71、CD45、p?ERK、p?JNK、t?ERK 及 t?JNK 抗體（均以 1∶1 000稀釋）室溫條件孵育1 h，經PBST洗3次后，利用HRP標記的山羊抗兔IgG二抗或山羊抗小鼠IgG二抗（1∶1 000稀釋）繼續孵育1 h。最后進行ECL 顯色，通過智能圖像工作站GelView 6000 plus 進行成像，采用Image J 1.52a 軟件對Western blot條帶進行灰度分析并進行定量，檢測多糖處理前后各種分子的表達量變化。

1.3 統計學方法 使用SPSS 20.0 進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnet-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SPP 抑制 Jurkat 細胞增殖 1 g/L SPP 組、2 g/L SPP 組和5 g/L SPP 組細胞增殖抑制率分別為53.286%±3.112%、80.075%±4.240% 和 86.430%±4.614%，差異有統計學意義（F=10 518.812，P＜0.05）。與對照組比較，SPP 顯著抑制Jurkat 細胞增殖，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。

2.2 SPP 誘導 Jurkat 細胞凋亡 2 g/L、5 g/L SPP 組cleaved caspase?3 蛋白表達水平高于對照組，5 g/L SPP 組高于 1 g/L SPP 組（P＜0.05），1 g/L SPP 組cleaved caspase?3 蛋白表達水平與對照組差異無統計學意義，見圖1、表1。

Fig.1 The effect of SPP on Jurkat cell apoptosis圖1 SPP對Jurkat細胞凋亡水平的影響

Tab.1 Comprision of protein expression levels of cleaved caspase-3,CD45,CD71,p-ERK,t-ERK,p-JNK and t-JNK between the four groups表1 4組cleaved caspase-3、CD45、CD71、p-ERK、t-ERK、p-JNK和t-JNK蛋白相對表達水平比較

2.3 SPP 影響 CD45 和 CD71 表達 1 g/L、2 g/L SPP組CD45 蛋白表達水平高于對照組（P＜0.05），CD71蛋白表達水平與對照組差異無統計學意義；5 g/L SPP 組CD45 蛋白表達水平均高于對照組、1 g/L 和2 g/L SPP 組，CD71 蛋白表達水平低于對照組（P＜0.05），與1 g/L和2 g/L SPP 組差異無統計學意義，見圖2、表1。

2.4 SPP 影響ERK 磷酸化水平 對照組、1 g/L SPP組、2 g/L SPP組和5 g/L SPP組p?ERK蛋白表達水平依次升高，組間多重比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；各組間t?ERK、p?JNK和t?JNK蛋白表達水平差異均無統計學意義，見圖3、表1。

3 結論

Fig.2 The effect of SPP on cell surface receptors of Jurkat cells圖2 SPP對Jurkat細胞膜受體表達量的影響

Fig.3 The effect of SPP on signal molecules in Jurkat cells圖3 SPP對Jurkat細胞內部信號分子表達量的影響

白血病是我國十大高發惡性腫瘤之一，臨床上治療白血病主要以多藥物聯合化療的方式為主，但受到藥物耐受以及嚴重不良反應等因素影響，白血病的整體預后并不理想［1?3］。多糖是一種天然高分子聚合物，具有抗腫瘤活性和不良反應小等特點，是潛在的新型抗腫瘤藥物［13］。目前已發現多種多糖對白血病細胞具有明顯的抑制作用，如枸杞多糖［14］、香菇多糖［15］、肉蓯蓉多糖［16］、姬松茸多糖［17］、杏鮑菇多糖［18］。SPP 是螺旋藻的重要活性成分之一，近年來研究表明，SPP對白血病細胞具有一定的殺傷作用，但具體作用機制尚未明確［8?11］。本文首先通過MTT法研究不同劑量SPP對人急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat細胞增殖的影響，結果發現SPP能夠顯著抑制Jurkat細胞增殖，并推測利用較高劑量SPP處理Jurkat細胞時，可能誘導細胞發生凋亡。

細胞凋亡，又稱細胞程序性死亡，是由基因控制的細胞程序性死亡過程［19］。細胞凋亡是機體維持動態平衡的關鍵因素之一，腫瘤細胞往往是由于細胞凋亡機制失衡而導致的不斷增殖、逃離凋亡的過程。因此，特異性地誘導腫瘤細胞凋亡是目前臨床腫瘤治療的熱門研究領域［20］。為了進一步證實SPP能否誘導Jurkat 細胞凋亡，本研究采用Western blot 法檢測 SPP 是否誘導 caspase?3 活化。Caspase?3 是細胞凋亡通路的關鍵分子之一，正常以酶原（pro?casp?3，分子質量32 ku）形式存在，當細胞發生凋亡后，會激活caspase?3 水解為 cleaved caspase?3（分子質量為17 ku和19 ku），最終誘導細胞凋亡［21］。本研究結果顯示，SPP在低劑量下主要抑制細胞增殖，而高劑量下能夠誘導細胞凋亡。林祥偉等［17］研究姬松茸多糖對白血病細胞K562 增殖、凋亡的影響，發現低劑量（2 g/L）姬松茸多糖處理細胞48 h后能夠抑制細胞增殖，而高劑量（10 g/L）多糖能夠顯著誘導白血病細胞凋亡，與本研究結果一致，說明不同劑量多糖對細胞的影響有所不同，可能是由于不同劑量的多糖作用細胞膜表面的受體數量、作用方式等不同導致的。

SPP 屬于生物活性多糖大分子，不能夠自由通過細胞膜，主要通過影響Jurkat 細胞膜表面受體的表達和分布，進而將凋亡信號傳遞到細胞內部［22］。CD45 是T 細胞膜表面重要受體之一，參與T 細胞發育、分化、活化以及凋亡等多個過程［23?24］。Xue等［25］研究發現CD45是腫瘤相關因子galectin?3誘導T細胞凋亡過程的關鍵凋亡受體，沉默CD45基因可顯著降低galectin?3誘導的細胞凋亡水平。CD71與白血病細胞增殖分化密切相關，已經成為腫瘤靶向治療的潛在靶點之一［26?27］。本研究中5 g/L SPP誘導T細胞凋亡的同時，顯著促進CD45表達，并且抑制CD71的表達水平，提示CD45 和CD71 可能是SPP 誘導T細胞凋亡的受體之一。

多糖的結構十分復雜，不同種類多糖由于結構差異，結合細胞膜表面受體種類及數量各異，因此不同多糖對于細胞生長和凋亡的作用及機制不盡相同［13］。馬莉等［15］研究發現香菇多糖通過抑制PI3K/AKT信號分子，最終活化caspase?3誘導白血病HL?60 細胞凋亡。張濤等［16］研究發現肉蓯蓉多糖通過引起白血病K562 細胞周期阻滯而達到抑制細胞生長、增殖的目的，但并未發現該多糖能夠誘導K562細胞發生凋亡。朱紅等［28］研究顯示硒酸軟骨素多糖通過降低細胞線粒體膜電位最終激活caspase?9，誘導K562細胞凋亡。ERK、JNK與細胞增殖、分化、凋亡等過程密切相關，是細胞內的重要信號分子［29?31］。本研究發現各劑量SPP 均能夠顯著誘導ERK 磷酸化，由于低劑量（1 g/L 和2 g/L）SPP 以抑制Jurkat 細胞增殖為主，高劑量（5 g/L）以誘導細胞凋亡為主，提示ERK磷酸化同時參與SPP抑制細胞增殖與誘導細胞凋亡的過程。此外，JNK不參與SPP抑制Jurkat細胞增殖與誘導細胞凋亡全過程。

綜上所述，SPP能夠抑制T細胞增殖并且在高劑量（5 g/L）條件誘導T細胞凋亡。高劑量SPP主要通過上調細胞膜表面受體CD45和下調CD71將凋亡信號傳遞到細胞內部，通過活化ERK，最終激活caspase?3，誘導細胞凋亡。